惡性膠質瘤干細胞分泌的外泌體誘導人單核細胞分化為M2巨噬細胞以及調控PD-L1的表達

外泌體由含有嵌入蛋白和RNA的膽質層構成，其三維結構穩定。它可以保護生物活性，增強生物分布，并支持與局部或遠處組織中的靶細胞的相互作用。
     外泌體可以介導惡性腫瘤之間動態交流，即使存在血腦屏障的中樞神經系統和免疫系統中的游離型外泌體也有這種作用。
     近日，來自美國德州大學MD安德森癌癥中心的Heimberger團隊在《Oncoimmunology》(IF=7.719)發表的《Glioblastoma stem cell-derived exosomes induce M2 macrophages and PD-L1 expression on human monocytes》一文中探討了膠質母細胞瘤（GBM）來源干細胞（GSCs）分泌的外泌體（GDEs）是否可誘導免疫抑制。研究結果發現GDEs傾向于被巨噬細胞前體——單核細胞攝取。GDEs進入單核細胞的細胞質，導致肌動蛋白細胞骨架的重組，并使單核細胞朝向免疫抑制性M2表型（包括程序性死亡配體1（PD-L1）表達）極化。質譜分析表明，GDEs含有多種組分，包括信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）途徑的成員，其功能介導該免疫抑制轉換。 Western blot分析顯示GSC外泌體處理的單核細胞和GBM患者浸潤的CD14 +細胞中的PD-L1的上調主要與STAT3的磷酸化增加相關，并且在一些情況下與p70S6激酶和Erk1 / 2的磷酸化相關。這些數據表明GDEs分泌的GBM釋放因子，是GBM相關免疫抑制性微環境的強效調節劑。

技術路線

實驗結果

1．免疫細胞群體對外泌體的攝取是可變的

圖1.外泌體的特征鑒定。（A）成纖維細胞MRC5、膠質瘤細胞U87、膠質瘤干細胞GSC20和GSC267細胞外泌體的代表性直方圖。（B）GSC20外泌體的透射電子顯微鏡圖像。（C）和（D）流式細胞術分析結合到免疫磁珠的GSC20和MRC5外泌體。

圖2.免疫群體對外泌體的攝取是可變的。（A）GBM患者PBMCs與PKH67標記的GSC外泌體(GSC-Exo)共培養，用流式細胞儀檢測各種免疫細胞群對GSC-Exo的攝取情況；（B）GBM患者（左）和健康獻血者（右）的免疫細胞群體攝取PKH-67標記的GSC20-Exo的數據。（C）用抗CD3/CD28抗體激活T細胞，用PMA和離子霉素激活NK細胞，然后將細胞與PHK67標記的GSC20外泌體孵育6小時。流式細胞儀檢測被CD4+或CD8+T細胞及CD56+NK細胞攝取的外泌體。

2.GSC-Exo定位于單核細胞的細胞質中，并誘導單核細胞其肌動蛋白重組

圖3.人單核細胞外泌體內化過程。（A）單核細胞攝取外泌體的動力學研究。（B）（C）PKH67標記的外泌體被單核細胞攝取的共聚焦顯微鏡圖像。（D）用共聚焦顯微鏡觀察單核細胞與PKH67標記的外泌體共培養48小時后Phalloidin標記的細胞結構情況。白色箭頭指示肌動蛋白重組（E）外泌體孵育的單核細胞的胞質區。

3.GSC-Exo誘導單核細胞極化為M2巨噬細胞表型

圖4.GSC-Exo將單核細胞極化為M2樣表型。（A）用不同來源外泌體孵育的單核細胞中M1和M2標記蛋白的表達情況（左）及PD-L1（右）的平均熒光強度[MFI ]。（B）GBM患者組織中的單核細胞標志物IbA1（綠色）和PD-L1抗體（紅色）染色圖像。（C）外泌體孵育單核細胞后MCP-3和CXCL1的相對像素密度。

4.GSC-Exo含有EIF2、mTOR和EphrinB信號通路蛋白

圖5 GSC-Exo和成纖維細胞外泌體的蛋白質組學分析。（A）GSC來源（GSC20、GSC17、GSE267）的外泌體與成纖維細胞（MRC5，WI38）外泌體差異蛋白的通路注釋。（B）成纖維細胞（MRC5，WI38）外泌體和GSC外泌體差異蛋白火山圖。

圖6 GSC外泌體和成纖維細胞外泌體蛋白的亞細胞定位和功能分析。（A）成纖維細胞源性外泌體的蛋白質和GSC外泌體蛋白質的亞細胞定位；（B）成纖維細胞源性外泌體的蛋白質和GSC外泌體蛋白質的功能。

5. GSC外泌體誘導人單核細胞PD-L1上調，與STAT3磷酸化有關

圖7外泌體孵育的人單核細胞PD-L1通路分析及GBM患者血液和腫瘤組織分離的CD14+細胞的PD-L1通路分析（A）p- STAT3、P- STAT1、P- Akt、β-actin、HSP70在成纖維細胞、GSCs、成纖維細胞和GSC衍生的外泌體表達分析。（B）用成纖維細胞和GSC衍生的外泌體處理兩個供體的單核細胞中PD-L1、P- STAT3、STAT3、GAPDH的表達分析。（C）經外泌體孵育的人單核細胞中PD-L1和P- STAT3蛋白表達的密度分析。（D）PD-L1、p- STAT3、p- STAT1、p-ERK1／2、pJNK、pp70S6K和GADPH在健康對照外周血CD14+細胞、GBM患者的CD14+細胞和GBM浸潤的CD14+細胞的Western分析。