導語：曲妥珠單抗耐藥已成為乳腺癌治療的主要障礙，間充質干細胞(MSCs)在耐藥性的形成過程中發揮關鍵作用，然而，其潛在機制尚不清楚。長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)參與腫瘤進展，參與調節曲妥珠單抗耐藥性。MSCs與lncRNAs產生哪些調控效應，這里告訴你。

參考文獻：IF=7.971

技術路線：

結果：

1. MSC引起乳腺癌（BC）細胞干性和曲妥珠單抗耐藥
為分析MSCs對干性和曲妥珠單抗耐藥的影響，將SKBR-3和BT474兩種HER-2 + BC細胞系與MSCs共培養，發現細胞的球形形成能力顯著提高，干性基因均顯著上調，CD4陽性細胞的比例增加。CCK8檢測結果顯示骨髓間充質干細胞培養降低了曲妥珠單抗介導的細胞毒性，表明骨髓間充質干細胞在體外誘導曲妥珠單抗耐藥。

在異種移植模型中證實MSC的作用。將SKBR-3細胞注射到裸鼠體內，或與骨髓間充質干細胞混合注射，各組腹腔內給予曲妥珠單抗治療。結果發現SKBR-3細胞單獨作用未能生成異種移植物，然而，與骨髓間充質干細胞的細胞混合物成功建立了異種移植物，增加了SKBR-3細胞移植的腫瘤重量。IHC檢測曲妥珠單抗耐藥組織和BC患者曲妥珠單抗應答組織中MSC表面抗原CD29和CD90的表達，發現耐藥組CD29 +/CD90 + 患者的比例顯著增高，較高的CD29 +/CD90 + 組織與臨床分期呈正相關。以上結果提示骨髓間充質干細胞共培養可誘導干性和曲妥珠單抗耐藥。

2. MSC誘導的lncRNA AGAP2-AS1介導干性和曲妥珠單抗耐藥

為鑒定AGAP2-AS1是否由骨髓間充質干細胞誘導，檢測其在與骨髓間充質干細胞共培養的SKBR-3和BT474細胞中的表達，發現與MSCs共培養的細胞中AGAP2-AS1顯著上調。AGAP2-AS1在CD29 + CD90 + 患者BC組織中上調。研究AGAP2-AS1對干性的影響，過表達AGAP2-AS1后BC細胞中AGAP2-AS1和干性基因上調，CD44 + BC細胞比例增加，誘導BC細胞球體形成和曲妥珠單抗耐藥。沉默AGAP2-AS1效果相反。這些表明MSC通過誘導AGAP2-AS1引起干性和曲妥珠單抗耐藥。

3. AGAP2-AS1對干性和曲妥珠單抗耐藥性的作用依賴于FAO

使用starBase3.0獲得AGAP2-AS1的靶基因，并通過DAVID6.8進行KEGG通路分析。發現AGAP2-AS1靶基因在代謝中顯著富集，如FAO代謝。MSC共培養誘導了CPT1的活性和β-氧化率的增強，這種效應被敲除AGAP2-AS1所抵消。AGAP2-AS1的沉默也可逆轉MSC引起的CPT1、乙酰輔酶A合成酶(ACS)和ATP水平的上調。為證實FAO對于MSC-AGAP2-AS1誘導的干性和曲妥珠單抗耐藥性至關重要，使用FAO抑制劑依托莫西韋，發現抑制FAO可逆轉AGAP2-as1誘導的干性基因，可消除AGAP2-AS1誘導的曲妥珠單抗耐藥。表明MSC通過AGAP2-as1介導FAO誘導干性和曲妥珠單抗耐藥。

4. AGAP2-AS1與HuR相互作用

進一步探索AGAP2AS1的調控機制，利用RNA FISH和細胞核-細胞質分離qPCR鑒定亞細胞位置。結果提示，AGAP2-AS1位于細胞質。使用生物素化的AGAP2-AS1進行了RNA pull down實驗，質譜分析和western blotting鑒定出AGAP2-AS1的RNA結合蛋白-ELAV家族成員HuR。RIP試驗進一步證實AGAP2-AS1和HuR之間的直接相互作用RNA-FISH驗證AGAP2-AS1和HuR共定位在SKBR-3細胞的細胞質中，系列缺失分析發現AGAP2-AS1的900-1531nt區域對與HuR結合至關重要。POSTAR2預測在AGAP2-AS1的937-957nt區域顯示HuR的結合基序。而且，敲除HuR可消除干性和曲妥珠單抗耐藥性。上述結果證實AGAP2-AS1可能通過與HuR蛋白相互作用，在干性和曲妥珠單抗耐藥中發揮重要作用。

5. AGAP2-AS1-HuR復合物促進CPT1的穩定性
由于CPT1在AGAP2-AS1調節的FAO過程中上調，假設CPT1可能是AGAP2-AS1–HuR復合物的直接靶點。MSCs共培養誘導CPT1的上調，當AGAP2-AS1在骨髓間充質干細胞中沉默時，這種上調被廢除，證明MSC來源的AGAP2-AS1誘導CPT1上調。敲低HuR可顯著抑制CPT1表達，并在轉錄和蛋白水平均可消除AGAP2-AS1誘導的CPT1表達。通過CPT1 RNA探針進行RNA pull down，驗證HuR和CPT1之間的直接相互作用，HuR抗體進行RIP分析進一步驗證。

使用放線菌素D阻斷RNA轉錄時， HuR沉默細胞中CPT1 RNA的穩定性被顯著抑制。過表達AGAP2-AS1增加CPT1 mRNA的穩定性，HuR沉默顯著逆轉此類效應，表明HuR對于AGAP2-AS1誘導的CPT1 mRNA穩定性至關重要。以上結果表明AGAP2-AS1–HuR直接結合CPT1 mRNA并維持其穩定性。

6. AGAP2-AS1海綿miR-15a-5p釋放CPT1
HuR部分逆轉AGAP2-AS1誘導的效應，假設AGAP2-AS1可能存在其他調節途徑，如作為競爭性內源性RNA。在線預測軟件鑒定AGAP2-AS1靶向的miRNA，qPCR驗證4個miRNA在AGAP2-AS1過表達BC細胞中下調，發現CPT1被預測為評分較高的miR-15a-5p的靶點。雙熒光素酶報告基因檢測顯示，miR-15a-5p可顯著抑制AGAP2-AS1和CPT1的熒光素酶活性，pull down試驗證實了AGAP2-AS2與miR-15a-5p、miR-15a-5p和CPT1之間的直接相互作用。miR-15a-5p模擬物顯著抑制干性，增加曲妥珠單抗介導的細胞毒性，逆轉AGAP2-AS1引起的CPT1水平升高。共表達miR15a-5p可消除AGAP2-AS1誘導的干性蛋白和曲妥珠單抗耐藥性。以上結果證明AGAP2-AS1/miR-15a-5p/CPT1調節軸在干性和曲妥珠單抗耐藥中的重要作用。

7. AGAP2-AS1促進體內干性和曲妥珠單抗耐藥性
為證實AGAP2-AS1在干性和曲妥珠單抗耐藥性中的重要作用，在BALB/c裸鼠中建立了異種移植瘤模型。將轉染pcDNA-AGAP2-AS1的SKBR-3細胞與骨髓間充質干細胞混合后接種于小鼠皮下，小鼠接受曲妥珠單抗治療。發現曲妥珠單抗治療顯著抑制了腫瘤生長，然而，當細胞與AGAP2-AS1過表達時，這種效應被急劇逆轉，過表達AGAP2-AS1的SKBR-3細胞生成的腫瘤表現出較高的AGAP2AS1和較低的miR-15a-5p表達。曲妥珠單抗在異種移植物中減少的CPT1的表達可通過AGAP2-AS1過表達來挽救。IHC分析顯示，在過表達AGAP2-AS1的異種移植物中，CPT1染色較高，而AGAP2-AS1未改變HuR染色。表明AGAP2-AS通過靶向體內CPT1介導干性和曲妥珠單抗耐藥性。

8. AGAP2-AS1預測BC患者對曲妥珠單抗的治療反應

分析接受曲妥珠單抗治療的患者血清樣本，發現無應答患者中AGAP2-AS1上調。受試者工作特征(ROC)曲線顯示AGAP2-AS1在區分有反應和無反應患者方面具有相對較高的預測價值，ROC曲線將患者分為AGAP2-AS1高表達或低表達組，AGAP2-AS1高表達組對曲妥珠單抗治療表現出反應的患者百分比遠低于AGAP2AS1低表達組。