腹主動脈瘤（AAA）是一種嚴重的慢性炎癥性疾病，可導致腹主動脈局部擴張超過正常直徑的50%，可能引發血管破裂，導致高發病率和死亡率。目前已知 circRNA可調控巨噬細胞焦亡，進而促進AAA中的炎癥與基質金屬蛋白酶（MMP）活性協同作用，但circRNA在調節AAA中巨噬細胞焦亡的具體作用尚不明確。本研究旨在探討巨噬細胞焦亡啟動子circHipk3對AAA的貢獻及其潛在機制。研究發現，與正常動脈相比，主動脈瘤中CircHipk3明顯上調。在經circHipk3治療的小鼠中，巨噬細胞焦亡促進了炎癥與MMP合成的協同作用，顯著加速了血管緊張素（Ang）II和豬胰彈性蛋白酶（PPE）酶誘導的AAA形成。機制方面，通過RNA純化分離染色質表明，circHipk3通過與Stat3相互作用促進巨噬細胞焦亡，增加主動脈中的NLRP 3水平，并通過結合Snd 1促進Ptbp1 mRNA降解以抑制自噬。總之，該研究揭示了circHipk3在巨噬細胞焦亡中的重要作用，其通過雙重機制誘導動脈瘤形成和進展。該研究于2024年11月發表在《Clinical and Translational Medicine》上，IF：7.9。

技術路線：

主要研究結果：

1. 人類腹主動脈瘤和血管緊張素II誘發的小鼠AAA中均觀察到細胞焦亡標志物表達升高和纖維化增加

為了確定細胞焦亡是否在人類和小鼠動脈瘤中發揮作用，作者評估了細胞焦亡標志物，包括NLRP3、CASP1、GSDMD和IL-1β，并分析了人類主動脈瘤和小鼠AAA中的MMP2/9。此外，作者進行了Masson三色染色以觀察膠原纖維的狀況。從接受AAA切除術的患者身上采集了人體組織和相應的相鄰AAA正常樣本。Masson三色染色顯示AAA患者主動脈中的膠原蛋白減弱。qPCR結果表明，細胞焦亡標志物NLRP3、CASP1和IL-1β的表達在人類AAA中顯著上調。Western blotting結果顯示，與非動脈瘤組織相比，誘導細胞外基質(ECM)降解的NLRP3、MMP2和MMP9在人和小鼠主動脈瘤組織中顯著增加。在Ang II誘導的小鼠AAA中，Masson三色染色、qPCR和Western blotting實驗的結果與人AAA樣本的結果一致。免疫組化呈現NLRP3、CASP1、GSDMD和IL-1β的表達趨勢。免疫組化用于檢查人和小鼠AAA樣本中NLRP3、CASP1、GSDMD和IL-1β的表達趨勢。結果顯示，在人和小鼠AAA中，這些與細胞焦亡相關的關鍵蛋白的表達水平均上調。總的來說，研究結果表明增強的細胞焦亡與AAA的病理進展之間存在潛在關聯。

2. CircHipk人類和小鼠AAA組織表達增加

CirHipk3是一個1099bp的環狀RNA，來源于Hipk3基因外顯子2，位于2號染色體(qE2)，如circBank(http://www.circbank.cn/;mmu_circ_0001052;圖1A)中所述。圖1B說明了circHipk3的三維結構。首先，作者證實circHipk3比線性轉錄本更穩定(圖1C)。進行免疫熒光染色(圖1D)并使用定量實時PCR從巨噬細胞中分離細胞質和核RNA(圖1E)以確定circHipk3的亞細胞分布。結果表明circHipk3主要位于巨噬細胞的細胞質中。

接下來，為了驗證circHipk3參與AAA形成的病理過程，作者檢測了人AAA和小鼠AAA中circHipk3的表達情況。qPCR檢測和ISH結果均表明，人AAA組織中circHipk3的表達明顯高于鄰近的非動脈瘤組織（圖1F，G）。如前所述，作者建立了AngII誘導的小鼠AAA模型和PPE誘導的小鼠AAA模型，以及兩者的對照，以研究AAA組和對照組小鼠主動脈circHipk3表達水平的不同。總體而言，與對照組小鼠相比，AAA模型小鼠的腹主動脈凸起更明顯，表明成功建立了廣為接受的AAA模型類型（圖1H）。qPCR和ISH鑒定出AngII和PPE誘導的AAA模型小鼠中circHipk3的表達水平明顯高于野生型對照小鼠（圖1H-M）。此外，作者檢測了ApoE?/?和C57BL/6J小鼠不同器官和組織中circHipk3的表達，發現qPCR檢測顯示circHipk3在主動脈中最豐富（圖1N）。作者進一步評估了人和小鼠AAA組織中circHipk3與細胞焦亡標志物NLRP3、CASP1和IL-1β表達之間的相關性。結果表明，在人AAA組織中，circHipk3的表達與NLRP3和IL-1β的表達呈正相關。雖然circHipk3和CASP1之間存在正相關的趨勢，但并未達到統計學意義。類似地，在小鼠AAA樣本中，circHipk3表達與NLRP3和CASP1表達呈正相關。然而，circHipk3和IL-1β之間呈正相關的趨勢未達到統計學意義。這表明circHipk3可能與細胞焦亡有關，并可能參與調節AAA的病理過程。此外，為了闡明AAA中circHipk3的細胞來源，作者對人和鼠樣本進行了circHipk3與巨噬細胞標志物CD68和平滑肌細胞標志物α-SM-actin的免疫熒光共染色。作者的研究結果顯示，在正常小鼠主動脈中circHipk3的表達極少，α-SM-actin的表達較高，表明沒有共定位，并且沒有CD68表達。在AngII誘導的小鼠AAA中，circHipk3和CD68的表達均顯著增加，且存在顯著的共定位，而α-SMactin表達顯著降低，重疊最小。在PPE誘導的小鼠AAA中也觀察到了類似的情況。與小鼠數據一致，人類無病主動脈(NDA)和AAA樣本顯示出可比的結果。上述結果表明，小鼠AAA中的circHipk3主要來源于巨噬細胞，并且可能主要在這些細胞內發揮其功能。

圖 1 人類和小鼠腹主動脈瘤(AAA)組織中circHipk3表達增加

3. CircHipk3促進巨噬細胞焦亡

為了檢驗巨噬細胞是否是導致AAA發生和發展的主要細胞亞群，并確定在AAA的背景下，細胞焦亡是否主要發生在這些巨噬細胞中。作者從健康小鼠和用彈性蛋白酶治療14天以誘發動脈瘤的小鼠的IAA（GSE152583，PMID：32678909）中獲取了scRNA-seq數據。在對scRNA-seq數據集進行質量控制、數據整合、降維和聚類后，作者根據標記基因手動識別了3017個細胞中的九種不同細胞類型（圖2A、B）。結果表明，與假手術組相比，AAA組的巨噬細胞百分比顯著增加（圖2C）。選擇通過平均對數（倍數變化）確定的每種細胞類型的前五個特定標記基因，以將每種細胞類型與所有其他細胞類型區分開來（圖2D）。此外，通過UMAP和小提琴圖可視化，作者觀察到與假手術組相比，彈性蛋白酶14 d組的巨噬細胞亞群中，細胞焦亡標志基因NLRP3、CASP1和GSDMD選擇性上調（圖2E）。作者的研究結果表明巨噬細胞作為細胞焦亡的主要細胞，參與了AAA細胞焦亡的病理過程。進一步探討circHipk3在巨噬細胞中的生理作用。

在細胞實驗中，作者用LPS誘導巨噬細胞發生細胞焦亡。首先，為了進一步確認circHipk3是否除了巨噬細胞外還在血管平滑肌細胞（VSMC）中發揮作用，作者檢查了circHipk3在VSMC中的定位、其對細胞焦亡的影響以及其相對含量。作者發現circHipk3也主要位于細胞質中，可以促進VSMC中細胞焦亡標志物NLRP3的表達，但與巨噬細胞相比，其在VSMC中的表達較低，這表明circHipk3主要不在VSMC中起作用。在后續的細胞實驗中，作者發現在LPS誘導的細胞焦亡基礎上，敲低circHipk3降低了qPCR檢測到的NLRP3、CASP1、IL-1β和IL-18的mRNA水平（圖2F）。透射電子顯微鏡顯示LPS刺激的巨噬細胞具有指示細胞焦亡的特征，包括：(1)細胞腫脹和細胞內細胞器破壞，(2)大量囊泡和細胞碎片釋放，(3)染色質凝聚和核膜破裂。敲低circHipk3后，這些細胞焦亡的形態特征減弱。在染色質染色實驗（TUNEL）中，敲低circHipk3導致巨噬細胞凋亡減少。免疫熒光染色顯示，敲低circHipk3可降低LPS刺激后巨噬細胞焦亡標志物CASP1和NLRP3的激活（圖2G，H）。此外，敲低circHipk3可降低PI染色評估的巨噬細胞壞死率（圖2I）。同樣，當circHipk3被敲低時，NLRP3、clCASP1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的蛋白質印跡結果也相似（圖2J）。總之，結果表明巨噬細胞在AAA焦亡中起主導作用，而circHipk3可以促進巨噬細胞焦亡。

圖 2 circHipk3促進巨噬細胞焦亡。骨髓來源的巨噬細胞(BMDM)用si-SCR或circHipk3小干擾RNA片段轉染24 h，然后用濃度為 500 ng/mL 的脂多糖 (LPS) 處理另外24 h

4. 敲低circHipk3可抑制ApoE?/?小鼠中AngII誘導的AAA形成，而過表達circHipk3可促進AngII誘導的C57BL/6J小鼠中AAA形成

為了進一步明確circHipk3是否參與AAA的發生發展，作者采用攜帶circHipk3敲除構建體的AAV-9（sh-circHipk3）或攜帶circHipk3過表達構建體的AAV-9（AAVcircHipk3）以及相應的假病毒對照組（(AAV)-SCR-RNA/AAV-mScarlet）進行功能獲得和喪失實驗。免疫熒光證實circHipk3過表達或敲低構建體成功整合到主動脈壁中。qPCR證實circHipk3過表達或circHipk3敲低組小鼠主動脈中circHipk3水平上調或下調。宏觀觀察發現，sh-circHipk3小鼠腹主動脈膨大明顯小于SCR-RNA組轉染的apoE?/?小鼠（圖3A）。同樣，超聲成像也顯示出同樣的趨勢（圖3B）。與SCR-RNA組相比，敲低circHipk3可以降低AAA的發生率（圖3C），而sh-circHipk3組的破裂率和主動脈最大直徑降低（圖3D，E），表明circHipk3可以促進AAA形成。作者進一步觀察了circHipk3是否通過促進細胞焦亡和ECM降解來誘導AAA形成。與作者的假設一致，彈性纖維染色（EVG）顯示敲低circHipk3可以抑制AngII誘導的彈性蛋白降解，膠原纖維染色（Masson）顯示sh-circHipk3組小鼠的纖維化較少（圖3F，G）。免疫組化染色顯示，在sh-circHipk3小鼠中，巨噬細胞標志物CD68、細胞焦亡標志物NLRP3、CASP1和金屬蛋白酶MMP2和MMP9的表達顯著降低（圖3H-L）。Western印跡結果表明，敲低circHipk3可降低小鼠主動脈中NLRP3、GSDMD-N、cleavedCASP1、IL-18、IL-1β、MMP2和MMP9的表達水平（圖3M）。相反，與AAV-mScarlet組相比，在受AngII刺激的C57BL/6J小鼠中過表達circHipk3可促進AAA形成（圖4A），而超聲成像（圖4B）、AAA發生率（圖4C）、AAA破裂率（圖4D）和最大主動脈直徑（圖4E），反映AAA病變嚴重程度的circHipk3在AAV-mScarlet組中增加。與這些結果一致，過表達circHipk3促進了AngII誘導的彈性蛋白降解（圖4F），AAV-circHipk3小鼠表現出更多的纖維化（圖4G）。免疫組織化學顯示，過表達circHipk3上調了巨噬細胞標志物CD68、細胞焦亡標志物NLRP3、CASP1、金屬蛋白酶MMP2和MMP9的表達（圖4H-L）。Westernblot結果顯示，過表達circHipk3顯著增加了細胞焦亡標志物NLRP3、GSDMDN、cleavedCASP1、IL-18、IL-1β、金屬蛋白酶MMP2和MMP9的表達（圖4M）。根據這些結果，circHipk3足以通過促進巨噬細胞焦亡來引發AAA，隨后觸發炎性細胞因子分泌和ECM降解。為了進一步闡明circHipk3在AAA內巨噬細胞中的作用，作者生成了HBAAV2/2-F4/80病毒，該病毒含有驅動circHipk3表達的巨噬細胞特異性啟動子。在確認主動脈巨噬細胞成功轉導并評估轉導效率后，作者觀察到在針對腹主動脈的巨噬細胞中特異性過表達circHipk3導致AAA病變大小增加，NLRP3表達上調。表明circHipk3在巨噬細胞焦亡中起重要作用，并影響AAA的進展。

圖 3 敲低circHipk3可抑制Ang II誘導的AAA形成并降低與細胞焦亡和金屬蛋白酶相關的炎癥分子的水平

圖 4 circHipk3的過度表達促進Ang II誘導的AAA形成并增加與細胞焦亡和金屬蛋白酶相關的炎癥分子的水平

5. 敲低circHipk3可抑制C57BL/6J小鼠中PPE誘導的AAA形成，而過表達circHipk3可促進C57BL/6J小鼠中PPE誘導的AAA形成

為了探索circHipk3對AAA形成的潛在影響是否獨立于AngII，并考慮到所用動物模型和病毒感染模式的可能影響，作者擴展了研究范圍，使用PPE誘導的AAA模型和ADV干預技術深入研究circHipk3在AAA發展中的作用。免疫熒光證實circHipk3過表達或敲低構建體成功整合到主動脈壁中。qPCR證實circHipk3過表達或circHipk3敲低組小鼠主動脈中circHipk3水平上調或下調。將PPE應用于小鼠腎下主動脈外膜2周后，結果顯示，宏觀上，sh-circHipk3組小鼠腹主動脈凸起不明顯，而SCR-RNA組小鼠則無此表現（圖5A）。此外，sh-circHipk3組小鼠腹主動脈最大直徑減小（圖5B）。彈性纖維（EVG）染色顯示，shcircHipk3組小鼠彈性蛋白的降解程度較SCR-RNA組輕（圖5C）。膠原纖維染色（Masson）結果顯示，sh-circHipk3組小鼠纖維化程度較低（圖5D）。免疫組織化學染色顯示，當敲低circHipk3時，巨噬細胞標志物CD68、細胞焦亡標志物NLRP3、CASP1和金屬蛋白酶MMP2和MMP9表現出與AngII誘導的AAA中觀察到的趨勢相同的趨勢（圖5E-I）。此外，Westernblot結果顯示，敲低circHipk3可降低PPE誘導的AAA中NLRP3、GSDMD-N、cl-CASP1、IL-18、IL-1β、MMP2和MMP9的表達（圖5J）。

相反，從宏觀上看，與ADVmScarlet組相比，C57BL/6J小鼠中circHipk3的過表達導致PPE誘導下的AAA擴張更顯著（圖6A）。ADV-circHipk3組的最大主動脈直徑增加（圖6B）。此外，circHipk3的過表達促進了PPE誘導的彈性蛋白降解（圖6C），AAV-circHipk3小鼠表現出更多的纖維化（圖6D）。免疫組織化學顯示，circHipk3的過表達上調了巨噬細胞標志物CD68、細胞焦亡標志物NLRP3、裂解CASP1、金屬蛋白酶MMP2和MMP9的表達（圖6E-I）。Westernblot結果顯示，過表達circHipk3可顯著增加細胞焦亡標志物NLRP3、GSDMDN、cl-CASP1、IL-18、IL-1β、金屬蛋白酶MMP2和MMP9的表達（圖6J）。總體而言，在PPE誘導的AAA中，circHipk3還會促進巨噬細胞焦亡，從而引發炎癥因子的分泌和ECM的降解，加速AAA的進展。

圖 5 敲低circHipk3可抑制豬胰腺彈性蛋白酶(PPE)誘導的AAA形成，并降低與細胞焦亡和金屬蛋白酶相關的炎癥分子水平

圖 6 circHipk3的過度表達促進PPE誘導的AAA形成并增加與細胞焦亡和金屬蛋白酶相關的炎癥分子的水平

6. CircHipk3通過與Stat3相互作用促進巨噬細胞焦亡

接下來，作者進一步闡明circHipk3在巨噬細胞中發揮作用的潛在機制。作者進行了ChIRP分析并切除了circHipk3特異性帶進行質譜分析（圖7A）。在將circHipk3特異性結合蛋白與基因卡中的細胞焦亡相關基因重疊后，作者確定了10種重疊的細胞焦亡相關蛋白以供進一步分析（圖7B）。隨后，作者進行了進一步分析，以展示GSE51227（PMID：25358394）轉錄組數據集中10種重疊的細胞焦亡相關蛋白的差異表達。PCA顯示AAA樣本和對照明顯分離成離散簇（圖7C）。在10種重疊的細胞焦亡相關蛋白中，Stat3和Tlr2的表達水平在GSE51227數據集中不同（圖7D，E）。所描繪的熱圖和差異表示圖提供了令人信服的證據，表明Stat3和Tlr2在GSE51227數據集中表現出明顯不同的表達水平（圖7F、G）。qPCR證實Stat3和Tlr2水平在AAA中上調（圖7H）。

作者選擇Stat3作為潛在靶蛋白，因為它在激活NLRP3炎癥小體中起上游作用，并已確定參與AAA的進展。根據catRAPID網站(http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group)的預測，circHipk3可能與Stat3相互作用(圖7I)。此外，作者隨后通過進行RIP測定證實了circHipk3和Stat3之間的相互作用，結果表明，與非特異性IgG抗體相比，抗Stat3抗體可使circHipk3富集(圖7J)。發現Stat3與circHipk3特異性結合，這通過蛋白質印跡法得到驗證(圖7K)。根據Genotype-TissueExpression項目(https://gtexportal.org/home/)的表達數據，Stat3mRNA在主動脈和冠狀動脈中高度表達(圖8L)。Westernbolt的結果表明Stat3在人AAA中高表達(圖8M)。接下來，作者研究了circHipk3和Stat3之間的相互作用是否影響Stat3水平。增強的circHipk3顯著增加了巨噬細胞中的Stat3蛋白水平(圖7N)。為了闡明circHipk3和Stat3相互作用的分子機制，作者使用蛋白質合成抑制劑環己酰亞胺(CHX)處理了circHipk3敲低的巨噬細胞。值得注意的是，與對照巨噬細胞相比，circHipk3敲低的巨噬細胞中Stat3的半衰期顯著縮短，這表明circHipk3對Stat3降解具有延緩作用。(圖7O)。接下來，作者進一步探討了Stat3的過表達是否影響NLRP3和IL-1β以及IL-18的蛋白質表達水平。作者的相關性分析表明，在細胞焦亡關鍵基因中，NLRP3與Stat3的關聯程度最高（圖7P、Q）。先前的研究表明，Stat3能夠結合NLRP3啟動子并增強H3K9乙酰化和NLRP3轉錄，以及NLRP3/CASP1介導的細胞焦亡。19–23Stat3的過表達上調了NLRP3、IL-1β和IL-18的蛋白質表達水平（圖7R–U）。此外，為了證明Stat3促進IL-1β和IL-18的成熟，作者評估了過表達Stat3的巨噬細胞中IL-1β和IL-18的RNA水平，并使用ELISA測量細胞上清液中成熟的IL-1β和IL-18的水平。作者的研究結果表明，Stat3的過表達顯著上調了巨噬細胞中的RNA水平以及ELISA檢測的上清液中IL-1β和IL-18的水平。circHipk3的過表達增強了NLRP3、IL-1β和IL-18的表達；然而，這種影響被Stat3的敲低所消除。總之，上述結果表明circHipk3通過Stat3-NLRP3-IL-1β/IL-18通路調節巨噬細胞焦亡。

圖 7 CircHipk3通過與Stat3相互作用促進巨噬細胞焦亡

圖 8 CircHipk3通過促進Ptbp1 mRNA降解來抑制自噬，從而促進巨噬細胞焦亡

7. CircHipk3通過促進Ptbp1mRNA降解來抑制自噬，從而促進巨噬細胞焦亡

先前研究表明，細胞內自噬在清除過量的NLRP3炎癥小體中起著關鍵作用，自噬的減弱會導致NLRP3炎癥小體的積累。24–26此外，研究表明circHipk3抑制自噬的形成。27–29作者觀察到過表達circHipk3會抑制自噬相關蛋白Atg5和Beclin1的表達(圖8A，B)。相反，敲低circHipk3會促進自噬形成，免疫熒光分析和自噬通量增加(圖8C)都證明了這一點。此外，作者用透射電子顯微鏡觀察到敲低circHipk3后巨噬細胞的自噬小體顯著增加，表明circHipk3對自噬有抑制作用。使用維恩圖方法，作者確定了Ptbp1和Snd1是與自噬調節相關的circHipk3下游靶點（圖8D）。RIP測定證實了Snd1和Ptbp1與circHipk3的特異性結合，隨后的蛋白質印跡法也證實了這一點（圖8E-G）。生物信息學預測、qPCR和蛋白質印跡分析進一步證實了AAA條件下Ptbp1和Snd1水平升高（圖8H-J）。值得注意的是，circHipk3的過表達與Ptbp1表達增加有關，表明circHipk3水平與Ptbp1穩定性呈正相關。為了探索circHipk3和Ptbp1相互作用的分子機制，先前的研究發現circRNA可以影響Ptbp1mRNA的穩定性。作者研究了circHipk3是否會影響Ptbp1mRNA的穩定性并介導Ptbp1的表達。使用放線菌素D和二甲基亞砜(DMSO)抑制RNA合成的實驗表明，circHipk3會隨時間破壞Ptbp1mRNA的穩定性(圖8K)。對Snd1作用的進一步研究表明，它顯著影響BMDM中Ptbp1mRNA的半衰期(圖8L、M)。這使作者假設Snd1促進了circHipk3和Ptbp1mRNA之間的相互作用，從而增強了Ptbp1的穩定性。在BMDM中敲低Snd1后進行的RNA下拉分析證實了circHipk3探針對Ptbp1mRNA的富集減少，突出了Snd1對circHipk3和Ptbp1-3'UTR結合能力的影響(圖8N)。此外，在過表達circHipk3后，作者觀察到自噬蛋白Beclin1水平下降。然而，當作者過表達Ptbp1時，這種影響被逆轉了。總之，作者的研究結果表明Snd1可能通過調節circHipk3和Ptbp1RNA分子之間的相互作用來調節Ptbp1mRNA水平。

結論：

總之，研究結果表明，circHipk3在促進細胞因子分泌和MMP合成的協同作用中起著關鍵作用，從而加劇了巨噬細胞焦亡并有助于AAA的形成。從機制上講，circHipk3通過與Stat3相互作用，增加主動脈中的NLRP 3水平，并通過結合Snd 1促進Ptbp1 mRNA降解以抑制自噬，從而促進巨噬細胞焦亡來增強這種協同效應。鑒于其在AAA發病機制中的中心參與，circHipk3成為減輕AAA形成和破裂的有希望的治療靶點。旨在調節circHipk3水平或活性的努力有可能預防和管理這種使人衰弱的血管疾病。

實驗方法：

qRT-PCR、WB、IF、RNA原位雜交、超聲成像、ChIRP、碘化丙啶染色、TUNEL染色、ELISA、細胞培養、轉染及處理、建立小鼠疾病模型

參考文獻：

Cai D, Li C, Zhang Y, et al. CircHipk3 serves a dual role in macrophage pyroptosis by promoting NLRP3 transcription and inhibition of autophagy to induce abdominal aortic aneurysm formation. Clin Transl Med. 2024;14(12):e70102. doi:10.1002/ctm2.70102