卵巢癌是一種具有最高復發率和死亡率的婦科惡性腫瘤。盡管尼拉帕利可以有效影響其進展，但藥物耐藥性的挑戰仍然存在。在此，我們構建了尼拉帕利耐藥的卵巢癌細胞系，通過RNA原位構象測序識別異常激活的增強子和相關靶基因。值得注意的是，靶基因RAD23A在尼拉帕利耐藥細胞中顯著上調，抑制RAD23A恢復了它們的敏感性。此外，尼拉帕利耐藥細胞中糖酵解的異常激活誘導了乳酸積累，促進了組蛋白H4K12賴氨酸殘基的乳酸化。相關性分析顯示，關鍵的糖酵解酶如丙酮酸激酶M和乳酸脫氫酶A在卵巢癌中與RAD23A表達顯著正相關。此外，H4K12la通過MYC轉錄因子激活了尼拉帕利和RAD23A表達的超增強子（SE），從而增強了DNA損傷修復能力，促進了卵巢癌細胞的藥物耐藥性?？偟膩碚f，本研究的結果表明，乳酸積累導致組蛋白H4K12la的乳酸化，從而上調SE介導的異常RAD23A表達，促進卵巢癌細胞對尼拉帕利的耐藥性，提示RAD23A可能是尼拉帕利耐藥卵巢癌的潛在治療靶點。本文于2025年3月發表于“Molecular Cancer”（IF=27.7）上。

技術路線：

結果：

1）尼拉帕利耐藥卵巢癌細胞中超增強子與靶基因啟動子之間的相互作用圖譜

         為了獲得與卵巢癌尼拉帕利耐藥相關的超增強子（SEs）及其靶基因之間的相互作用圖譜，我們使用卡鉑（10 μM）處理A2780/Nira和HO8910/Nira細胞48小時來模擬藥物誘導的DNA損傷，然后通過藥物濃度梯度法誘導尼拉帕利耐藥性（圖1A）。CCK-8實驗揭示了尼拉帕利的IC50值（圖1B–E）。將A2780/Nira和HO8910/Nira細胞的RIC-seq數據與公共增強子數據相結合，獲得了與尼拉帕利耐藥性相關的SEs及其靶基因之間的相互作用圖譜（圖1F）。RIC-seq測序檢測到SE區域在chr19:13004808–13,072,187（命名為Nira-SE）與靶基因的啟動子區域頻繁相互作用，包括RAD23A、RNU2-2P、WDR74和RP11-424C20.2。其中，Nira-SE與RAD23A啟動子區域的相互作用最為顯著（圖1G）。

2）靶向RAD23A逆轉了卵巢癌對尼拉帕利的耐藥性

         為了闡明RAD23A在卵巢癌尼拉帕利耐藥性中的作用，分析了卵巢癌細胞系A2780、A2780/Nira、HO8910和HO8910/Nira中RAD23A的表達。值得注意的是，尼拉帕利耐藥細胞中的RAD23A mRNA和蛋白質水平高于非耐藥細胞（圖1HJ）。對GSE40595、GSE66957數據集和GEPIA2網站的分析顯示，RAD23A在卵巢癌組織中的表達增加（圖1K），并且KMplot生存分析和GEPIA2數據集將RAD23A的高表達與卵巢癌的不良預后相關聯（圖1L）。為了評估RAD23A在尼拉帕利耐藥卵巢癌細胞中的功能，我們轉染了siRAD23A來敲減RAD23A的表達（圖2A和B）。CCK-8實驗顯示，敲減RAD23A增加了卵巢癌細胞對尼拉帕利的敏感性（圖2C和D）。此外，集落形成和EdU實驗揭示，尼拉帕利耐藥細胞的增殖能力在RAD23A敲減后顯著降低（圖2E和F）。另外，RAD23A的過表達在預先用鉑類藥物處理的A2780和HO8910細胞中增加了尼拉帕利耐藥性和細胞增殖能力（圖2G-J）。構建了尼拉帕利耐藥細胞的異種移植腫瘤模型和來自卵巢癌患者的類器官模型，以驗證RAD23A的體內治療效果。值得注意的是，與siNC組相比，siRAD23A組在皮下腫瘤形成方面表現出顯著的抑制作用；siRAD23A與尼拉帕利聯合治療組在皮下腫瘤形成方面的抑制作用顯著高于siNC+尼拉帕利組（圖2K）。同樣，對類器官的分析顯示，與siNC組相比，siRAD23A組在類器官生長方面表現出顯著的抑制作用；siRAD23A與尼拉帕利聯合治療組在類器官生長方面的抑制作用也顯著高于siNC+尼拉帕利組（圖2L和M）。

3）RAD23A通過調節DNA損傷修復參與卵巢癌的尼拉帕利耐藥

         RAD23A是NER途徑的重要組分，能夠修復由紫外線輻射和化學藥物等多種因素引起的DNA損傷。因此，在尼拉帕利耐藥卵巢癌細胞中評估了其修復DNA損傷的能力。免疫熒光實驗顯示，RAD23A的過表達可以減少預先用鉑類藥物處理的A2780和HO8910細胞中γ-H2AX的表達，γ-H2AX是雙鏈DNA損傷的標志物（圖3A-B）。此外，彗星實驗確認了RAD23A過表達后DNA損傷程度的降低，這表明RAD23A高水平可以增加DNA損傷修復（圖3C-D）。此外，下調RAD23A顯著增加了DNA損傷（圖3E-H）。類似地，小鼠異種移植腫瘤組織的免疫組化結果顯示，siRAD23A+尼拉帕利組在γ-H2AX表達上出現了顯著增加（圖3I）。這些結果提示，RAD23A通過調節DNA損傷修復參與卵巢癌對尼拉帕利的耐藥性。

4）阻斷超增強子逆轉了卵巢癌對尼拉帕利的耐藥性

         為了闡明RAD23A在卵巢癌化療耐藥性中的表觀遺傳重塑機制，進行了生物信息學分析。值得注意的是，在FANTOM5門戶網站上，Nira-SE區域鑒定出了兩個增強子，分別命名為E1（chr19:13023589–13,024,232）和E2（chr19:13048278–13,048,689）（圖4A）。接下來，利用CRISPR-Cas9技術敲除了E1和E2（圖4B和C），以評估它們對RAD23A轉錄活性的影響。qPCR和western blotting的結果顯示，敲除E1或E2中的任何一個都顯著降低了RAD23A的表達，而在E1和E2聯合敲除后，RAD23A的表達進一步下調（圖4D和E）。為了評估阻斷Nira-SE對卵巢癌尼拉帕利耐藥性的影響，特別在A2780/Nira和HO8910/Nira細胞中敲除了E1和E2。CCK-8實驗顯示，敲除E1或E2增加了耐藥細胞對尼拉帕利的敏感性（圖4F和G）。此外，集落形成和EdU實驗表明，敲除E1或E2后，尼拉帕利耐藥細胞的增殖能力顯著降低（圖4H和I）。此外，敲除E1或E2后，γ-H2AX的表達顯著增加（圖4J），DNA損傷程度加?。▓D4K）。

5）Nira-SE促進致癌TF MYC向啟動子的募集

         TFs介導SE調控網絡并以基因特異性的方式啟動轉錄。因此，通過交叉比對JASPAR、PROMO、Cistrome和ENCODE數據庫的預測結果，識別了與RAD23A相關的TFs?？偣茶b定出了七個TFs，分別是YY1、USF2、MYC、E2F1、RELA、GATA1和USF1（圖5A），并驗證了它們在卵巢癌中的作用。值得注意的是，敲減MYC顯著降低了RAD23A的mRNA水平（圖5B和C）和蛋白質水平（圖5D–F）。ChIP-qPCR分析顯示，MYC富集于A2780和HO8910細胞的RAD23A啟動子（圖5G和H）、增強子E1和E2區（圖5I和J），且在其相對耐尼帕尼細胞（圖5K-M）中富集更為顯著，表明MYC是參與耐尼帕尼卵巢癌中RAD23A轉錄調控的關鍵TF。接下來，評估了SEs對MYC介導的RAD23A基因轉錄激活的影響。ChIP-qPCR分析顯示，在E1和E2敲除后，MYC在RAD23A啟動子區域的富集顯著減少（圖5N），表明E1和E2敲除有效地抑制了MYC在RAD23A啟動子區域的富集，從而影響了其轉錄活性。

6）在尼拉帕利耐藥的卵巢癌細胞中糖酵解過程顯著激活

         糖酵解可以驅動腫瘤細胞的惡性進展和藥物耐藥性。因此，本研究評估了糖酵解和組蛋白乳酸化在卵巢癌獲得尼拉帕利耐藥性過程中RAD23A超增強子的形成和激活中的作用。因此，檢測了尼拉帕利耐藥細胞的糖酵解指標，包括耗氧率（OCR）、細胞外酸化率（ECAR）和乳酸生成。值得注意的是，與非耐藥細胞相比，A2780/Nira和HO8910/Nira細胞的OCR顯著降低（圖6A），而ECAR增加（圖6B）；耐藥細胞的乳酸產生顯著增加（圖6C）。進一步的體外實驗顯示，敲減糖酵解相關關鍵酶丙酮酸激酶M（PKM）或乳酸脫氫酶A（LDHA）顯著提高了它們對尼拉帕利的敏感性（圖6D），抑制了尼拉帕利耐藥細胞的增殖（圖6E），并增加了DNA損傷水平（圖6F）。相反，添加外源性乳酸增強了卵巢癌細胞的增殖和尼拉帕利耐藥性，并降低了DNA損傷水平。

7）組蛋白乳酸化促進RAD23A的表達

         盡管耐藥細胞中糖酵解的激活導致乳酸積累，但其對RAD23A基因表達的影響尚不清楚。因此，在GEPIA2和ICGC數據集中分析了己糖激酶2、PKM、LDHA與RAD23A的表達相關性。值得注意的是，PKM、LDHA和RAD23A的表達呈正相關（圖7A和B），并且在卵巢癌組織中PKM和LDHA的表達顯著增加（圖7C）。為了闡明糖酵解途徑通過組蛋白乳酸化對RAD23A轉錄和表達的調控作用，使用了一種泛乳酸化抗體來檢測乳酸化的整體水平。值得注意的是，尼拉帕利耐藥細胞中組蛋白位置的乳酸化水平顯著增加（圖7D），在添加外源性乳酸（乳酸鈉，Nala）后，乳酸化水平進一步增加，同時RAD23A的表達也增加（圖7E-F）。相反，當卵巢癌細胞用糖酵解抑制劑2-DG處理時，組蛋白乳酸化和RAD23A的表達顯著降低（圖7G）。在耐藥細胞中敲減PKM或LDHA顯著降低了RAD23A的mRNA和蛋白質水平，而添加外源性乳酸恢復了RAD23A的表達（圖7H和I）。

8）組蛋白H4K12la通過激活Nira-SE促進RAD23A的轉錄

         為了驗證組蛋白修飾位點在轉錄調控中的作用，檢測了尼拉帕利耐藥細胞中四種核心組蛋白（即H2A、H2B、H3和H4）的乳酸化情況。CO-IP結果顯示，尼拉帕利耐藥細胞中H4的乳酸化顯著增加（圖8A-B）。此外，在H4中識別出了多種常見的乳酸化賴氨酸殘基位點，包括H4K5la、H4K8la、H4K12la和H4K16la。值得注意的是，H4K12la在耐藥細胞中的增加最為顯著（圖8C-D）。同樣，外源性乳酸和2-DG分別顯著增加了和降低了H4K12la的水平（圖8E-F）。此外，在耐藥細胞中敲減PKM或LDHA導致H4K12la水平下降，而外源性乳酸逆轉了這一效果（圖8G-H）。這些結果表明，H4K12la乳酸化是調控尼拉帕利耐藥卵巢癌細胞的關鍵組蛋白修飾位點。

結論：

         本研究闡明了糖酵解和組蛋白乳酸化在調節卵巢癌尼拉帕利耐藥中基因表達的機制，提示NER途徑相關的RAD23A作為解決卵巢癌尼拉帕利耐藥的新治療靶點。

實驗方法：

         異種移植腫瘤實驗，CRISPR-cas9技術，CCK-8，EdU，集落形成試驗，免疫熒光，彗星試驗，qPCR，Western blotting，CO-IP，ChIP，RIC-seq

參考文獻：

         Lu B, Chen S, Guan X, Chen X, Du Y, Yuan J, Wang J, Wu Q, Zhou L, Huang X, Zhao Y. Lactate accumulation induces H4K12la to activate super-enhancer-driven RAD23A expression and promote niraparib resistance in ovarian cancer. Mol Cancer. 2025 Mar 19;24(1):83. doi: 10.1186/s12943-025-02295-w