血管生成素樣蛋白3（ANGPTL3）的N末端結構域抑制脂蛋白脂肪酶活性。其C端纖維蛋白原樣（FBN）結構域是巨噬細胞整合素αvβ3的配體。ANGPTL3可能是斑塊的所在地，它通過整合素αvβ3直接調節巨噬細胞功能，以促進動脈粥樣硬化的進展。接受高脂飲食的Ldlr^-/-小鼠和食物飲食的ApoE^-/-小鼠接受腺相關病毒（AAV）介導的ANGPTL3基因轉移并隨訪12周。ApoE^-/-小鼠注射含有FLAG標記的ANGPTL3 cDNA的AAV進行示蹤。比較ANGPTL3^-/- ApoE^-/-小鼠和ApoE^-/-同窩小鼠的動脈粥樣硬化特征。將THP-1細胞暴露于0或50μg/ml ANGPTL3 FBN結構域24h，以使用western blot分析評估Toll樣受體（TLR）4表達，并通過MILLIPLEX MAP測定循環細胞因子和趨化因子譜。在ANGPTL3處理的巨噬細胞中建立磷酸化蛋白質組學譜。使用Lentivirus-Cas9系統通過靶向RGD序列的sgRNAs獲得整合素β3缺陷的THP-1細胞。ANGPTL3過表達增加了動脈粥樣硬化進展和斑塊中CD68⁺巨噬細胞（p<0.05）。通過免疫染色，在基因轉移的ApoE^-/-小鼠的斑塊中鑒定出FLAG細胞。熒光免疫染色檢測到斑塊巨噬細胞中ANGPTL3和CD68⁺的共定位。磷酸化蛋白質組學分析顯示，ANGPTL3誘導THP-1細胞中參與IL-17信號通路的蛋白質磷酸化。在體外，ANGPTL3治療增加了THP-1細胞中白細胞介素（IL）-1β和腫瘤壞死因子-α的產生（p<0.05）。ANGPTL3暴露于THP-1細胞誘導Akt磷酸化，這在整合素β3缺陷型細胞中減弱。ANGPTL3通過Akt磷酸化升高TLR4表達。在對脂多糖的反應中，用ANGPTL3預處理的THP-1細胞的核因子-κB活性比未處理的細胞高2.2倍（p<0.05）。靶向ANGPTL3可以產生降低血液中脂質水平和抑制斑塊中巨噬細胞活化的雙重好處。

         本文于2025年3月發表在《JournalofAdvancedResearch》，IF 11.4。

主要實驗結果

1.肝臟過表達ANGPTL3會增加高膽固醇血癥患者的膽固醇水平和斑塊進展Ldlr^-/-小鼠

         我們首先評估了ANGPTL3在小鼠動脈粥樣硬化模型中的表達。Western blotting結果表明，Ldlr^-/- 高脂飲食組的小鼠肝臟ANGPTL3表達是普通飲食組的1.7倍。為了探究ANGPTL3對動脈粥樣硬化的影響，將Ldlr^-/-小鼠分別注射腺相關病毒載體或小鼠ANGPTL3 cDNA?；蜣D移完成后，小鼠立即接受高脂飲食喂養12周，以誘導高脂血癥和動脈粥樣硬化。基因轉移后12周，qPCR分析驗證了載體組和AAV-ANGPTL3組中的EGFP表達，但在未注射的對照組中未檢測到，表明基因轉移成功。

         高脂飲食12周后，肝臟ANGPTL3基因轉移誘導ANGPTL3的mRNA表達比載體組增加1.3倍，但差異未達到統計學意義（p=0.11，n=6-10）。由于ANGPTL3的蛋白質水平在未注射小鼠和載體注射小鼠之間無顯著差異（p≥0.57），因此在整個研究中將兩組合并為對照組。通過ELISA和western blot分別測定ANGPTL3基因轉移組和混合對照組之間ANGPTL3的肝臟和血液水平（血液ANGPTL3：18.4±6.7和19.8±4.9ng/mL，p=0.45，n=10-15；肝臟ANGPTL3：1.1±0.3 vs 1.2±0.4，p=0.41，n=7-11）。在葡萄糖耐量試驗中，ANGPTL3基因轉移對葡萄糖水平沒有影響（p≥0.48）。盡管ANGPTL3水平相似，但與載體轉移組相比，ANGPTL3基因轉移組的血漿膽固醇水平高于載體轉移組（總膽固醇：7.0±2.2mmol/L vs 8.7±2.1mmol/L，p=0.036，n=12-15;總甘油三酯：1.4±0.5mmol/L vs 1.3±0.6mmol/L，p=0.73，n=6-10）。

         通過H&E染色分析，ANGPTL3基因轉移組的主動脈斑塊大小遠高于載體組（26.5±4.8×104μm² vs 33.1±8.8×104μm²，p=0.017，n=17-20）。免疫組化染色顯示，與混合對照組相比，ANGPTL3轉移小鼠病灶中CD68⁺和α-SMA細胞的數量均顯著增加（CD68⁺巨噬細胞：146.9±18.0個/斑塊vs 165.6±20.3個/斑塊，p=0.031，n=11-13；α-SMA平滑肌細胞：146.8±12.2個/斑塊vs 172.8±12.5個/斑塊，p=0.0001，n=9–15）。

2.肝臟ANGPTL3過表達增加了ApoE^-/-小鼠的ANGPTL3水平和斑塊進展

         如上所述，AAV介導的ANGPTL3 cDNA轉移在高脂飲食喂養的Ldlr^-/-小鼠中不會顯著提高ANGPTL3蛋白的表達。這可能是由于高脂飲食介導的相對高水平的ANGPTL3誘導。此外，兩組之間血漿甘油三酯水平相似，表明高脂飲食的影響可能部分抵消了基因轉移對ANGPTL3誘導的影響。為了排除高脂飲食對動脈粥樣硬化的影響，在正常飲食的ApoE^-/-小鼠中重復相同的基因轉移實驗。

         斑塊大小隨著年齡的增長而增加，從在16周齡ApoE小鼠中的10,713μm²增加到25周齡的ApoE^-/-小鼠的107,070μm²，血漿ANGPTL3水平也是如此，其水平隨著年齡的增長而增加1.2倍（兩者的p<0.05，n=6-8）（圖1A和B）。基因轉移后12周，通過qPCR和western blotting在肝臟中檢測到EGFP表達（圖1C）。通過ELISA定量分析，與未注射對照相比，AAV介導的基因轉移在基因轉移后第4周和第12周分別誘導循環ANGPTL3水平增加1.3倍和1.8倍（基線：14.8±3.3ng/mL；第4周：19.9±1.4ng/mL；第12周：27.1±10.0ng/mL；兩者的p<0.01，n=5-10）（圖1D）。ApoE^-/-小鼠中肝臟過表達ANGPTL3不僅損害了葡萄糖耐量（曲線下面積：64.8±20.5 vs 80.5±24.8，p<0.007，n=5-6）（圖1E），而且與載體組相比，血漿膽固醇和甘油三酯水平升高（膽固醇：7.46±0.89mmol/L vs 9.80±1.39mmol/L；甘油三酯：0.69±0.14mmol/L vs 1.28±0.36mmol/L；兩者的p<0.0001，n=10–11）（圖1F）。

圖1.肝臟過表達ANGPTL3對高膽固醇血癥患者膽固醇水平和斑塊進展的影響Ldlr^-/-小鼠

         與Ldlr^-/-小鼠類似，ApoE^-/-小鼠的非注射組和載體注射對照組之間的主動脈斑塊大小相當（p=0.65）。因此，將這兩組合并。H&E分析顯示，與混合對照相比，AAV介導的ANGPTL3轉移導致主動脈斑塊大小增加1.5倍（13.4±3.7×10⁴μm ²vs 19.6±7.0×10⁴μm ²，p=0.003，n=17-18）（圖1G）。通過免疫染色發現，注射AAV-ANGPTL3的小鼠斑塊中CD68⁺巨噬細胞和α-SMA平滑肌細胞的數量分別比對照組高1.6倍和1.8倍（CD68⁺巨噬細胞：54.2±24.6 vs 84.3±36.0，p=0.02，n=12-18; α-SMA平滑肌細胞：28.9±13.5 vs 51.3±24.7，p=0.008，n=11-18）（圖1H和I）。H&E、CD68⁺和α-SMA染色的代表性圖像如圖1J-L所示。

3.ANGPTL3缺陷減輕了ApoE^-/-小鼠的斑塊進展

         為了進一步探究ANGPTL3的病理效應，使用Cas9技術建立ANGPTL3小鼠。將ANGPTL3和ApoE^-/-小鼠雜交以建立雙基因敲除（DKO）小鼠（圖2A-C）。對25周齡小鼠循環中ANGPTL3水平的ELISA定量分析顯示，與年齡匹配的ApoE^-/-同窩小鼠相比，DKO小鼠的水平顯著降低（14.2±4.0ng/mL vs 1.6±0.3ng/mL，p=0.001，n=5-9）（圖2D）。當受到20%葡萄糖刺激時，DKO小鼠的血糖水平低于ApoE^-/-小鼠（曲線下面積：1810.0±111.6 vs 1551.0±93.1，p=0.0006，n=4-11）（圖2E）。與ApoE^-/-同窩小鼠相比，DKO小鼠空腹血漿膽固醇和甘油三酯水平分別降低了36%和91%（膽固醇：7.3±1.3mmol/L vs 4.7±0.7mmol/L;甘油三酯：0.75±0.27mmol/L vs 0.07±0.09mmol/L，兩者的p≥0.0004，n=9-10）（圖2F和G）。

圖2.減輕ANGPTL3缺陷ApoE^-/-小鼠的斑塊進展

         接下來，建立循環細胞因子和趨化因子譜。通過MILLIPLEX^?MAP定量分析，DKO小鼠血漿中嗜酸性粒細胞趨化因子水平較ApoE^-/-小鼠降低了56%（589.0±301.7ng/mL vs 261.2±76.1ng/mL，p=0.0005，n=9）（圖2H）。H&E分析顯示，動脈粥樣硬化初始階段的斑塊大小相似，但隨著動脈粥樣硬化的發展，DKO小鼠的斑塊大小比ApoE^-/-小鼠小79%（13.9±7.6×10⁴μm² vs 3.0±1.9×10⁴μm²，p<0.0001，n=4-10）（圖2I）。

4.ANGPTL3歸巢至動脈粥樣硬化斑塊

         為了檢測循環中的ANGPTL3是否可以成為斑塊的棲息地，用抗小鼠ANGPTL3抗體對小鼠心臟切片進行免疫染色。與合并對照組相比，高脂飲食喂養Ldlr^-/-小鼠斑塊中的Angptl3信號強度提高了1.9倍（p=0.03）（圖3A）。斑塊中ANGPTL3染色的代表性圖像如圖3B所示。

圖3.ANGPTL3歸巢于動脈粥樣硬化斑塊

         為了進一步評估ANGPTL3在斑塊病變區域的歸巢情況，通過將FLAG肽序列整合到用于克隆ANGPTL3的cDNA構建體中來生成FLAG標記的小鼠ANGPTL3。在同一構建體中，添加了EGFP作為報告基因。轉染人293T細胞2天后，可在體外熒光顯微鏡下檢測到EGFP表達（圖3C）。Western blotting分析證實了這些細胞中重組EGFP-ANGPTL3-FLAG融合蛋白的產生（圖3D）。然后將該質粒構建體克隆到AAV構建體中，并通過尾靜脈注射到小鼠中?；蜣D移后12周，載體和AAV介導的EGFP-ANGPTL3-FLAGcDNA轉移組之間的血漿ANGPTL3蛋白水平和膽固醇水平相當（兩者的p≥0.25，圖3E和F）。然而，EGFP-ANGPTL3-FLAG組的血漿甘油三酯水平比載體組高1.4倍（0.62±0.08mmol/L vs 0.86±0.18mmol/L，p=0.04，n=4-12/組）（圖3F）。為了證明ANGPTL3基因轉移對LPL活性的影響，對載體和ANGPTL3基因轉移組的血漿樣品進行LPL活性測量。通過ELISA結果可知，EGFP-ANGPTL3-FLAGcDNA轉移組的LPL活性比載體組低13%（107.7±11.8U/L vs 93.7±11.5，n=6-12，p=0.03）（圖3G）。這些數據表明，盡管載體組和ANGPTL3基因轉移組之間的ANGPTL3水平相似，但ANGPTL3活性升高，LPL活性的抑制證明了這一點。

         因此，在過表達ANGPTL3的小鼠中，斑塊大小和斑塊中CD68⁺巨噬細胞的數量分別高出1.6倍和1.9倍（兩者的p<0.01）（圖3H和I）。在免疫染色下，載體組幾乎無法檢測到FLAG細胞，但在EGFP-ANGPTL3-FLAG組中表現突出（1.0±1.2 vs 6.8±2.8個每個斑塊，p=0.002，n=5-8）（圖3J）。FLAG染色的代表性圖像如圖3K-L所示。

5.ANGPTL3和巨噬細胞在斑塊中的共定位

         在觀察到CD68⁺巨噬細胞和ANGPTL3細胞表現出共同的分布模式后，用抗小鼠CD68⁺和抗小鼠ANGPTL3抗體（Abs）探測高脂飲食喂養的Ldlr^-/-小鼠和食物喂養的ApoE小鼠的小鼠心臟切片。共聚焦熒光顯微鏡顯示，在兩種基因型ANGPTL3轉移小鼠中，兩種抗體的信號在相同的細胞內共定位（圖4A）。

圖4.ANGPTL3和巨噬細胞在斑塊中的共定位

         為了測試ANGPTL3是否可以通過巨噬細胞發揮作用，對人THP-1細胞進行染色，以獲得抗整合素αvβ3（ANGPTL3受體）的抗體。免疫細胞化學顯示，在共聚焦熒光顯微鏡下，整合素αvβ3在THP-1細胞中大量表達（圖4B）。熒光激活細胞分選（FACS）分析證實了THP-1細胞中整合素αvβ3的表達（圖4C）。與PBS處理的對照相比，暴露于重組ANGPTL3 FBN結構域既未改變整合素αvβ3細胞的比例，也不改變該受體在THP-1細胞上的平均熒光強度（MFI）（整合素αvβ3+細胞百分比：97.9±0.5% vs 98.1±0.6，p=0.79，n=3；整合素αvβ3 MFI：247.3±34.8 vs 259.4±48.0，p=0.09，每個n=10）（圖4D）為了證明整合素αvβ3是否有效，對THP-1細胞進行遷移測定，其中PBS或ANGPTL3添加到下腔室。遷移6小時后，向ANGPTL3遷移的細胞數量比對照高1.3倍（每個顯微鏡視野中的遷移細胞數：19.2±4.5 vs 24.1±5.1，n=9，p=0.046）（圖4E）。這些數據表明，ANGPTL3對巨噬細胞功能的調節可能是由ANGPTL3/整合素αvβ3下游的信號通路介導的。

6.暴露于ANGPTL3的THP-1細胞中的磷酸化譜

         此前，ANGPTL3的FBN結構域已被證明可通過促進內皮細胞或脂肪細胞中的磷酸化途徑來調節細胞功能。為了闡明ANGPTL3調節巨噬細胞的潛在機制，將THP-1細胞剝奪血清過夜，然后用PBS或ANGPTL3 FBN結構域刺激15分鐘。由于磷酸化蛋白與蛋白表達密切相關，因此通過蛋白水平對失調的磷酸化蛋白進行標準化，以便進行精確分析。對細胞進行消化后進行蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學質譜分析。鑒定的肽段長度分布和肽質量分布在蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學中均顯示出良好的質量控制。使用主成分分析（PCA），個體圖顯示磷酸化蛋白質組學和蛋白質組學中兩組之間存在分離（圖5A）。

圖5.用ANGPTL3處理的THP-1細胞中的蛋白質磷酸化譜

         對于磷酸化蛋白質組學，共獲得262，767個光譜，其中43,833個光譜與現有數據庫匹配。在43,833個匹配光譜中，鑒定出2,824個蛋白質上的6,475個磷酸化位點（圖5B）。使用火山圖來展示ANGPTL3/對照比值為≥1.3或≤1/1.3的差異表達蛋白（圖5C）。在THP-1細胞中，總共有45種蛋白質和48個磷酸化位點被ANGPTL3上調（圖5C和D）。使用COG數據庫分類后，獲得83個功能未知的蛋白質。除此之外，這些蛋白質的前三個功能類別涉及翻譯后修飾、轉錄和復制（圖5E）。

         根據磷酸化位點的上調或下調進行分子功能和KEGG通路分析（圖5F和G），ANGPTL3誘導磷酸化的蛋白質參與了IL-17信號通路、過氧化物酶體和醚脂質代謝（圖5G）。

6.ANGPTL3FBN結構域增強THP-1細胞中炎性細胞因子的產生

         為了驗證磷酸化蛋白質組學結果，獲取了用ANGPTL3 FBN結構域處理的THP-1細胞的炎癥特征。暴露于PBS或ANGPTL3 FBN結構域24小時后，使用MILLIPLEX MAP測定法測定THP-1細胞培養物的細胞內容物和上清液中的一組細胞因子、趨化因子和生長因子。在蛋白質負載量正常化后，發現ANGPTL3 FBN結構域處理可引發一系列炎性細胞因子的產生，包括嗜酸性粒細胞趨化因子、GRO-α、IL-1β、IL-27、M-CSF、MIG、MIP-α和TNF-α（圖6A-H）。與對照細胞相比，ANGPTL3 FBN結構域處理細胞中上清液中IL-1β、MIP-α和TNF-α的濃度也增加了1.3-1.4倍（圖6I-K）。

圖6.ANGPTL3 FBN結構域增強了THP-1細胞中炎性細胞因子的產生

         如炎性細胞因子/趨化因子譜所示，在ANGPTL3處理的THP-1細胞中，M1巨噬細胞的標志物升高，例如IL-1β和TNF-α。鑒于iNOS和精氨酸酶1分別是M1和M2巨噬細胞的標志物，我們進一步證明了ANGPTL3在表型轉換中的潛力。處理24小時后，收獲細胞用于RNA提取。qPCR數據顯示，基線狀態下iNOS的相對mRNA表達量為0.95，但在ANGPTL3刺激的細胞中增加到1.32（0.95±0.34 vs 1.32±0.29，n=8，p=0.03）。相反，與對照組相比，ANGPTL3使精氨酸酶1的mRNA表達降低了40%（0.99±0.25 vs 0.59±0.19，n=5，p=0.02）（圖6L）。

         綜上所述，這些數據表明ANGPTL3 FBN結構域能有效調節巨噬細胞向M1表型轉換。

7.ANGPTL3 FBN結構域通過Akt磷酸化促進TLR4表達

         已有研究報道，在關節炎和肝炎等疾病中，巨噬細胞中存在由TLR4介導的IL-17生成現象。同樣，炎癥特征也表明TLR4/NF-κB通路被激活。為了證明這一點，THP-1細胞用ANGPTL3的FBN結構域（0和50μg/mL）處理24小時。通過qPCR和western blotting對TLR4表達的檢查表明，與對照組相比，ANGPTL3 FBN結構域刺激使TLR4的mRNA和蛋白質表達分別增加了1.7倍和1.3倍（qPCR：0.77±0.29 vs 1.19±0.42，p=0.038，n=6-7;western blotting：0.51±0.03 vs 0.64±0.09，p=0.009，n=4-10）（圖7A和B）。盡管用N末端ANGPTL3處理的THP-1細胞中mRNA水平總體上降低了42%，但TLR4蛋白質表達與PBS處理的對照組之間的表達相似（qPCR：p=0.001;western blotting：p=0.42）（圖7A和B）。

圖7.ANGPTL3 FBN結構域通過Akt磷酸化促進TLR4表達

         我們進一步研究了ANGPTL3對TLR4表達的調節是否通過磷酸化來介導。用PBS或ANGPTL3 FBN結構域刺激THP-1細胞15min。使用western blotting分析，與未處理的對照相比，ANGPTL3 FBN的結構域刺激使Akt的激活增加了1.8倍（p<0.05）（圖7C）。相比之下，與對照組相比，FBN結構域刺激并未誘導FAK磷酸化（p=0.69）（圖7C）。當使用抗β-肌動蛋白作為pAkt的內參時，也得到了類似的結果（基線：基線為0.33±0.05，5分鐘：0.48±0.08，15分鐘：0.58±0.03，n=4，p<0.05）。當被β-肌動蛋白校正后，pFAK水平在ANGPTL3刺激前后保持不變（兩者的p≥0.11）。

         為了驗證pAkt是否參與ANGPTL-3介導的TLR4表達，用ANGPTL3 FBN結構域處理THP-1細胞，有或沒有pAkt抑制劑的情況下培養24h。使用western blotting分析發現，抑制Akt磷酸化減弱了ANGPTL3誘導的TLR4表達（ANGPTL3 vs ANGPTL3+MK2206，p=0.0002）（圖7D）。然而，添加MK2206并未改變TLR4 mRNA水平（ANGPTL3 vs ANGPTL3+MK2206，p=0.90）（圖7E）。為了探究ANGPTL3是否通過與整合素β3中的RGD序列結合來激活pAkt，設計了兩個單導向RNA來利用CRISPR/Cas9系統靶向RGD序列。它們被包裝到慢病毒中以感染THP-1細胞。感染3天后，用嘌呤霉素和殺稻瘟菌素S選擇細胞7天。與載體組相比，Western blot分析顯示sgRNAs并未改變整合素β3的表達（p≥0.80）。ANGPTL3刺激后，所有組的總Akt水平保持不變（p≥0.45）。然而，與載體組相比，β3缺陷細胞中pAkt/總Akt的比率分別降低了36%和37%（載體：2.6±0.3；sgRNA-1：1.7±0.3；sgRNA-2：1.7±0.5）。由于兩種sgRNA導致相似水平的pAkt誘導（p=0.9），因此將pAkt/總Akt的數據合并為一組。通過Mann-Whitney分析，與載體組相比，整合素β3缺陷細胞的Akt磷酸化顯著降低（載體組pAkt/總Akt：2.6±0.3;整合素β3缺陷組：1.7±0.4，n=3-6，p=0.02）（圖7F）。當用β-肌動蛋白標準化時觀察到類似的結果（pAkt/β-actin：2.1±0.1 vs 1.8±0.2，n=3-6，p=0.02）（圖7F）。這些數據表明ANGPTL3通過與整合素β3的RGD結合促進Akt激活。

         在我們觀察到ANGPTL3處理的THP-1細胞中TLR4表達增加后，我們對基因轉移ApoE^-/-小鼠的心臟切片進行了抗TLR4染色。載體組每個斑塊的TLR4細胞數為74.2個，但ANGPTL3組增加到每個斑塊110.4個（每個斑塊細胞數：74.2±13.3 vs 110.4±23.6，n=5-8，p=0.01）（圖7F和H）。

8.在THP-1細胞中通過ANGPTL3增加NF-kB活性

         為了探討TLR4是否有效，首先將THP-1細胞分別用PBS和ANGPTL3一起孵育24小時，然后用100ng/mL LPS刺激15分鐘。在沒有LPS刺激的情況下，PBS和ANGPTL3處理的細胞之間的NF-κB活性相當（p=0.10）（圖7I）。LPS處理后，PBS處理的THP-1細胞的NF-kB活性增加了1.8倍，而預先用ANGPTL3 FBN結構域處理的細胞中，THP-kB活性攀升至4.2倍（p=0.002，圖7I）。

9.檢測人類斑塊中的ANGPTL3信號

         最后，我們在五名患者的腦血管動脈粥樣硬化斑塊中進行了血管造影引導下的ANGPTL3存在情況研究。石蠟包埋切片的免疫染色證實了這些斑塊標本中存在ANGPTL3信號（圖8A）。

圖8.ANGPTL3存在于人類斑塊中

結論

         我們的研究結果表明，除了升高血液中的膽固醇和甘油三酯水平外，ANGPTL3還會向斑塊聚集，在那里直接調節巨噬細胞的炎癥特性，導致動脈粥樣硬化發展。使用mAb或小干擾RNA靶向ANGPTL3可以通過降低血脂水平和減弱斑塊中M1巨噬細胞的活化帶來健康益處。

實驗方法

         主成分分析、蛋白質組學分析、qPCR、Western blot、ELISA、MILLIPLEX MAP分析、細胞培養、細胞轉染、細胞刺激實驗、細胞遷移實驗、流式細胞術、免疫熒光染色、小鼠模型、H&E染色、免疫組化染色、免疫組化染色、血漿分析

參考文獻

         Zhang Y, Yan C, Dong Y, Zhao J, Yang X, Deng Y, Su L, Yin J, Zhang Y, Sun F, Feng Y. ANGPTL3 accelerates atherosclerotic progression via direct regulation of M1 macrophage activation in plaque. J Adv Res. 2025 Apr;70:125-138. doi: 10.1016/j.jare.2024.05.011. Epub 2024 May 11. PMID: 38740260.