肥胖是乳腺癌發展和預后不良的一個確定的危險因素。乳腺腫瘤周圍的脂肪環境在肥胖中被炎癥化，這與腫瘤的進展有關，而髓樣細胞上表達的觸發受體2 （TREM2）是脂肪組織和腫瘤中巨噬細胞上表達的跨膜受體，是一個新興的癌癥治療靶點。為更好地了解肥胖與乳腺癌關聯的機制以及減肥的潛在益處，作者利用瘦、肥胖和減肥小鼠模型來研究TREM2缺乏對絕經后乳腺癌的影響。TREM2缺乏抑制了瘦小鼠的腫瘤生長，但在肥胖或減肥小鼠中沒有效果。腫瘤和腫瘤鄰近乳腺脂肪組織免疫細胞的單細胞RNA測序，結合可變多樣性連接測序，揭示了不同模型中免疫景觀的差異。瘦TREM2缺陷小鼠的腫瘤表現出克隆性CD8+ T細胞從衰竭狀態向效應記憶狀態的轉變，并伴有CD4+ Th1細胞克隆性的增加，這在任何其他飲食基因型組中都沒有觀察到。值得注意的是，在同一只小鼠的腫瘤和腫瘤鄰近乳腺脂肪組織中發現了相同的T細胞克隆型。最后，抗PD-1治療抑制了瘦小鼠和減肥小鼠的腫瘤生長，但在肥胖小鼠中沒有。這些發現表明，體重史可能影響絕經后乳腺癌TREM2抑制的效果。腫瘤和周圍脂肪組織之間的免疫相互作用在肥胖和減肥條件下突出了顯著差異。該文章于2025年4月發表在《Cancer Research》，IF：12.5。

摘要圖：

主要研究結果：

1. 絕經后乳腺癌的瘦、肥胖和減肥模型

         為了建立絕經后乳腺癌的肥胖和減肥模型，選擇了C57BL/6J小鼠品系，因為它有肥胖傾向，并已在代謝研究中建立了應用。在6周齡時，切除小鼠卵巢，以鼠糧喂養2周。隨后，瘦小鼠喂食低脂飼料23至24周，肥胖小鼠喂食低脂飼料12周，然后在研究的剩余時間內改為高脂飼料，減肥小鼠喂食高脂飼料12周，然后再喂食低脂飼料（圖1A）。每周記錄食物攝入量。肥胖和體重減輕可以從身體和oAT質量的變化中看出（圖1B和C），終點子宮萎縮證實卵巢切除術成功（圖1D）。葡萄糖耐量測試在11周（任何飲食轉換之前）和19周的飲食后進行。在服用HFD 11周后，與服用LFD的小鼠相比，減肥組已經肥胖，并且表現出更差的葡萄糖耐量。在第19周的時間點，肥胖組表現出更差的葡萄糖耐量，而減肥小鼠的葡萄糖清除率與瘦對照組相匹配（圖1E）。20周后注射E0771細胞，監測腫瘤3周。這種飲食模式賦予了一個重要的優勢：瘦鼠、肥胖鼠和減肥鼠在注射腫瘤細胞時處于相同的年齡，這使得從同一批細胞注射腫瘤細胞能夠最大限度地減少實驗差異。這允許在每個實驗組中同時監測腫瘤。肥胖小鼠腫瘤體積和腫瘤質量顯著增加，而減肥小鼠與瘦組無顯著差異（圖1F-H）。

圖1 在絕經后乳腺癌模型中，減肥可挽救腫瘤生長

2. 在表達TREM2的mATTum-adj中，LAM標記物上調并與腫瘤質量呈正相關

         脂肪組織中的LAM與肥胖有關，并且腫瘤中表達TREM2的巨噬細胞的免疫抑制性質已被報道。因此，作者將先前文獻中鑒定的LAM基因在瘦弱、肥胖和減肥小鼠腫瘤中的表達進行了量化。對腫瘤中的CD11b+細胞進行磁分選（圖2A）。LAM基因在腫瘤來源的CD11b+細胞中的表達在飲食組之間沒有差異（圖2B）。接下來，在mATTum-adj和mATContra中對LAM基因進行定量分析（圖2C）。與瘦的mATContra相比，肥胖的mATContra中只有TREM2的表達增加。然而，與瘦mATTum-adj和減肥mATTum-adj相比，肥胖mATTum-adj的TREM2和Plin2增加。肥胖的mATTum-adj比瘦的mATTum-adj Cd36增加。此外，在肥胖和減肥組中，相對于mATContra， mATTum-adj中的TREM2、Plin2和Cd36表達上調（圖2D-F）。為了確定腫瘤生長與LAM基因表達之間是否存在關系，作者進行了mAT LAM基因與腫瘤大小的相關性分析。在mATContra中，TREM2、Plin2或Cd36的表達與腫瘤質量沒有相關性(圖2G和H)；然而，在mATTum-adj中，TREM2和Plin2基因的表達與腫瘤質量呈正相關（圖2G和H）。

圖2 LAM標記基因在肥胖的mATTum-adj中增加，并與腫瘤質量呈正相關

3. 在絕經后乳腺癌模型中，TREM2缺乏可降低腫瘤生長

         在各種癌癥模型中，TREM2缺乏或用抗TREM2單抗治療可降低腫瘤生長。為了確定TREM2消融是否能減緩絕經后乳腺癌的腫瘤生長，作者切除了TREM2 +/+和TREM2 -/-雌性C57BL/6J小鼠的卵巢，并以鼠糧喂養（圖3A）。正如預期的那樣，TREM2-/-動物血漿中不存在sTREM2（圖3B）?；蛐椭g的體重、葡萄糖耐量（圖3C）或終點oAT和mAT質量均無差異。卵巢切除術后25周，注射E0771PD-L1細胞，監測腫瘤4周。所有TREM2-/-小鼠都出現了可觸及的腫瘤，而只有一只TREM2+/+小鼠沒有。與TREM2+/+對照組相比，TREM2-/-小鼠的腫瘤體積和腫瘤質量均顯著降低（圖3D和E）。TREM2-/-小鼠的oAT中Cd36基因表達顯著降低，Plin2和Cd9基因表達略有降低（圖3F）。oAT中M1樣和M2樣巨噬細胞標志物Nos2和Arg1均降低（圖3F）。TREM2-/- mATTum-adj表現出從小（直徑μm）脂肪細胞向大（直徑70-99 μm）脂肪細胞的轉變（圖3G-I）。先前關于雄性附睪脂肪組織的報道表明，TREM2缺陷小鼠的脂肪細胞嚴重肥大；然而，這些數據首次表明TREM2缺乏也會導致女性皮下脂肪組織庫中的脂肪環境失調。

圖3 在經周喂養的絕經后乳腺癌模型中，TREM2消融可減緩腫瘤生長，減少LAM，并增加脂肪細胞肥大

4. TREM2消融術在瘦弱動物中減弱腫瘤生長，但在肥胖或減肥動物中沒有

         為了評估在肥胖和體重減輕的情況下TREM2消融對腫瘤生長的影響，將切除卵巢的雌性TREM2 +/+和TREM2 -/-小鼠置于LFD和HFD組，形成瘦、胖和減肥組，并在飲食20周后注射E0771 PD-L1。在每個飲食組中，基因型之間的體重軌跡沒有差異（圖4A）。與瘦和減肥TREM2+/+小鼠相比，肥胖TREM2+/+小鼠的血漿中sTREM2水平升高，而TREM2-/-小鼠的血漿中沒有sTREM2（圖4B）。與瘦TREM2+/+對照相比，瘦TREM2-/-小鼠的腫瘤生長減弱，這一點可以通過終點腫瘤質量和體積隨時間的變化來證明（圖4C和D）。然而，TREM2缺乏并沒有減少肥胖或減肥小鼠的腫瘤生長（圖4C、E和F）。

圖4 瘦但不是肥胖或減肥，TREM2-/-小鼠表現出腫瘤生長減少

圖5 用scRNA-seq分析腫瘤骨髓群和mATTum-adj

5. scRNA-seq顯示，瘦TREM2-/-小鼠腫瘤相關巨噬細胞中抗原呈遞基因的表達增加

         為了探索腫瘤的免疫學景觀和mATTum-adj，作者對CD45+免疫細胞進行了scRNA-seq（圖4）。UMAP分析在腫瘤中鑒定了21個簇，在mATTum-adj中鑒定了33個簇，顯示了每個簇的前3個DEGs。由于TREM2在骨髓細胞上表達，來自兩種組織的骨髓群體被亞群化并重新聚集（圖5A和B），并計算了每個組織內每個細胞群體的頻率（圖5C和D）。觀察到骨髓群體的一些變化，特別是在瘦TREM2-/-腫瘤中，與瘦TREM2+/+腫瘤相比，Mono_Cd16集群減少，cDC3_Fscn1和Macro_Isg15集群增加（圖5C）。作者的RT-PCR數據顯示，整個腫瘤的TREM2表達不受肥胖或體重減輕的影響（圖2B）。在作者的scRNA-seq數據集中，TREM2主要在Macro_C1qc亞群中表達，這是一個更促炎的巨噬細胞群，參與抗原呈遞，在腫瘤的飲食組之間沒有變化（圖5E）。然而，在mATTumadj中，肥胖增加了巨噬細胞中TREM2的表達，正如在其他脂肪組織庫中發生的那樣(圖5F)。在腫瘤Macro_C1qc群體中測定瘦TREM2+/+和瘦TREM2-/-之間的前5個deg，隨后在所有實驗組中進行評估（圖5G）。與瘦TREM2+/+組相比，瘦TREM2-/- Macro_C1qc（腫瘤）和LAM （mATTum-adj）群體中，前5個DEGs中的4個，H2-Eb1、H2-Ab1、H2-Aa和Cd74相對增加（圖5H）。這些基因是抗原呈遞的組成部分，這將作者的重點放在T細胞群上。

6. 克隆T細胞群在瘦的TREM2-/-小鼠腫瘤中從疲憊狀態轉變為效應狀態，而不是肥胖或減肥小鼠

         腫瘤T細胞群的初步分析包括細胞比例和頻率（圖6A和B），以及腫瘤T細胞群的亞聚類（圖6C）。在瘦小鼠中，與TREM2+/+對照相比，TREM2-/-腫瘤顯示CD8+ TEM和CD4+ Th1細胞增加。在肥胖小鼠中，與TREM2+/+相比，這兩種T細胞群在TREM2-/-中增加；然而，與瘦肉對照組相比，兩種基因型均表現出明顯降低的細胞/腫瘤比例。在減肥組中，與飲食匹配的對照組相比，TREM2-/-中的CD8+ TEM和CD4+ Th1細胞減少（圖6A和B）。由于T細胞克隆擴增是靶向腫瘤細胞的必要條件，通過克隆細胞計數投影到按飲食和基因型分裂的重組腫瘤T細胞UMAP上，可以看到腫瘤T細胞的克隆性（圖6D-I）。在瘦TREM2+/+腫瘤中發現了高度克隆的耗盡CD8+ T細胞（TEX）群體（圖6D），而瘦TREM2-/-小鼠的腫瘤則含有高度克隆的CD8+ TEM和CD4+ Th1群體（圖6E）。在肥胖動物中，總體克隆群體較少；然而，這兩種基因型都含有一些克隆性CD8+ TEX和CD8+ TEM（圖6F和G）。在減肥動物中，TREM2+/+腫瘤含有強大的克隆性CD8+ TEX群體，而TREM2-/-腫瘤顯示出總體克隆性顯著降低（圖6H和I）。引人注目的是，在瘦TREM2-/-腫瘤中豐富的高度克隆性CD4+ Th1細胞在其他飲食基因型組中不存在。這表明這些細胞可能在抑制瘦TREM2-/-小鼠腫瘤生長中起關鍵作用。將T細胞克隆分成單克隆體和低、中等或高克隆體，增強了瘦TREM2-/-腫瘤中CD4+ Th1細胞的增加（圖6J）。在瘦和肥胖組中，與飲食匹配的TREM2+/+對照組相比，克隆水平分組統計還強調了TREM2-/-小鼠中高克隆CD8+ TEM的擴增；然而，在減肥動物中沒有觀察到這種強勁的擴張?？紤]到飲食組和基因型組之間腫瘤T細胞克隆性的巨大差異，并考慮到脂肪組織微環境的影響，作者接下來研究了腫瘤和mATTum-adj內的克隆型。

圖6 腫瘤T細胞克隆的可視化和分類顯示，在瘦TREM2-/-腫瘤中，高度克隆的CD4+ Th1細胞擴增

圖7 腫瘤及mATTum-adj雙組織克隆的鑒定

7. 腫瘤與mATTum-adj相同克隆型的鑒定

         克隆擴增的T細胞既可以存在于腫瘤組織中，也可以存在于脂肪組織中，但兩者之間是否存在任何共享的克隆是未知的。通過對TCRβ的β鏈進行測序，作者根據互補決定區3確定了克隆型。T細胞克隆被分為三組：腫瘤克隆，它們只在腫瘤中被識別；僅存在于mATTum-adj；和雙組織克隆，通過在腫瘤和mATTum-adj中存在相同的TCRβ來鑒定（圖7A）。為了可視化每個類別中代表的T細胞亞群，在脂肪組織中鑒定的脂肪克隆和雙組織克隆的熱圖被投影到mATTum-adj T細胞UMAP上，如圖7B-D所示。同樣，將腫瘤中發現的腫瘤克隆和雙組織克隆（圖7E和F）投影到腫瘤T細胞UMAP上，如圖6C所示。單組織克隆分布在每個飲食基因型組中所有鑒定的T細胞群中（圖7B-D）。瘦TREM2+/+腫瘤主要含有CD8+ TEM雙組織克隆，而瘦TREM2-/-腫瘤顯示雙組織克隆分布在CD8+ TEX、CD8+ TEM和CD4+ Th1人群中（圖7E）。兩個肥胖基因型組在腫瘤中主要存在CD8+ TEM雙組織克?。▓D7E）。然而，減肥動物表現出與瘦動物不同的表型，其中TREM2+/+腫瘤在CD8+ TEX、CD8+ TEM和CD4+ Th1群體中表現出雙組織克隆的擴散，TREM2-/-腫瘤主要包含CD8+ TEM克隆（圖7E）。mATTum-adj雙組織克隆的熱圖顯示，與TREM2+/+飲食匹配的對照組相比，苗條和肥胖的TREM2-/- mATTum-adj表現出更多的雙組織克隆；然而，兩個減肥組都顯示mATTum-adj內雙組織克隆的減少（圖7F）。

         隨后，作者量化了mATTum-adj中僅脂肪克隆型和雙組織克隆型的數量。該分析顯示，在幾乎每一組中，至少40%在mATTum-adj中鑒定的克隆型也在腫瘤中發現（圖7G）。該分析還顯示，與飲食匹配的TREM2+/+對照相比，瘦和肥胖TREM2-/- mATTum-adj的雙組織克隆型增加，同時兩個減肥組的克隆型數量顯著減少。腫瘤中克隆型的定量顯示，在mATTum-adj中也檢測到明顯較小比例的克隆型（圖7H）。此后，作者量化了每個組織中克隆型的細胞計數，并使用mATTum-adj中的粗T細胞聚類和腫瘤中的細T細胞聚類進一步分類數據。在mATTum-adj中，與瘦TREM2+/+對照相比，瘦TREM2-/-樣品中的雙組織CD8+ T細胞增加，肥胖TREM2-/-動物中的雙組織CD8+ T細胞進一步增加。相比之下，減肥組TREM2-/- mATTum-adj中CD8+ T細胞的數量比減肥組TREM2+/+ mAT中減少（圖7I）。同時，在腫瘤中，與飲食匹配的TREM2+/+腫瘤相比，瘦和肥胖TREM2-/-腫瘤中雙組織CD8+ TEM、CD8+ TEX和CD4+ Th1細胞計數顯著增加，瘦TREM2-/-腫瘤中雙組織T細胞數量最多（圖7J）。與mATTum-adj相似，減肥腫瘤在TREM2-/-動物中表現出雙組織T細胞的減少（圖7J）。脂肪克隆細胞計數主要由自然殺傷T細胞（NKT）和Treg克隆組成，表明NKT和Treg群體主要局限于mATTum-adj。相反，CD8+ T細胞似乎更有可能被鑒定為mATTum-adj和腫瘤之間的雙組織克?。▓D7K）。相比之下，在腫瘤克隆細胞計數分析中，每個飲食基因型組擁有所有T細胞群（圖7L）。

圖8 肥胖小鼠對αPD-1治療沒有反應，也沒有表現出mATTum-adj或腫瘤中T細胞激活標記物的增加

8. 肥胖小鼠對αPD-1治療有抗性，并且沒有表現出活化T細胞的增加

         黑色素瘤和非小細胞肺癌的臨床研究表明，肥胖可能會導致免疫檢查點抑制劑的“矛盾效應”，肥胖患者的反應比瘦患者更有利；然而，這在絕經后乳腺癌或減肥的情況下還沒有得到很好的研究。與肥胖小鼠的腫瘤相比，來自TREM2+/+瘦和減肥小鼠的腫瘤每克腫瘤中所有T細胞群的數量更高，高克隆CD8+ TEX細胞的豐度更高（圖6A和J）。為了研究肥胖和減肥對絕經后乳腺癌模型中αPD-1治療的影響，作者制作了切除卵巢的瘦、肥胖和減肥組，記錄食物攝入量和體重。在20周時給小鼠注射E0771PD-L1細胞，在腫瘤監測的最后8天注射IgG或αPD-1抗體（圖8A）。瘦小鼠對αPD-1治療有反應，表現為腫瘤質量和體積減小，多只小鼠的腫瘤質量和體積完全消退（圖8B和C）。肥胖IgG組和αPD-1治療組在任何時間點的腫瘤質量/體積均無統計學差異（圖8B和D）。然而，減肥小鼠對αPD-1治療也有反應，表現為腫瘤質量和體積減?。▓D8B和E）。通過分離和順序磁分選從mATTum-adj中分離出CD11b+細胞和T細胞（圖8F）。與瘦IgG處理組相比，瘦αPD-1處理的mATTum-adjT細胞中T細胞活化標志物Pdcd1、Tigit、Tox和Lag3的基因表達增加（圖8G）。在肥胖組內，抗體治療組間T細胞活化標記物表達無差異；然而，與瘦α PD -1處理的動物相比，肥胖α PD-1處理組的Pdcd1、Tox和Lag3表達降低（圖8G）。腫瘤全組織裂解物顯示，減肥αPD-1治療組Cd8a、Pdcd1、Lag3和TREM2均升高，肥胖組無差異（圖8H）。此外，在分離的CD11b+細胞中，LAM基因TREM2、Plin2和Cd36的表達在肥胖的mATTum-adj和mATContra中復制了LAM的增加，而αPD-1治療不受影響。

結論：

         通過研究不同背景下的肥胖和體重減輕，包括TREM2缺乏和免疫檢查點治療，并評估所有研究中的腫瘤和周圍脂肪組織，獲得了體重史對脂肪組織和腫瘤微環境影響的重要見解。本研究的數據表明這些組織之間存在潛在的串擾，可能涉及T細胞運輸。這些發現表明，體重史是臨床醫生在患者護理中考慮的一個關鍵因素，因為它的影響可能因具體的臨床情況而異。

實驗方法：

         TREM2+/+和TREM2?/?研究、腫瘤細胞植入、野生型小鼠研究、體組成和糖耐量試驗、磁性分選、IgG和αPD-1給藥、可溶性TREM2定量、脂肪組織間質血管組分分離、腫瘤單細胞解離、scRNA-seq、scRNA-seq數據處理、降維和數據整合、無監督聚類和細胞注釋、差異表達分析、RNA分離、cDNA合成和RT-PCR

參考文獻：

         Pierro, E. W., Cottam, M. A., An, H., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Wellen, K. E., Makowski, L., Rathmell, J. C., Fingleton, B., & Hasty, A. H. (2025). Comparison of Lean, Obese, and Weight-Loss Models Reveals TREM2 Deficiency Attenuates Breast Cancer Growth Uniquely in Lean Mice and Alters Clonal T-cell Populations. Cancer research, 85(7), 1219–1235.