M2型巨噬細胞在侵襲性實體瘤的腫瘤微環境中發揮著關鍵作用。它們與神經周圍浸潤（PNI）密切相關，且常與不良預后相關聯。在此背景下，腫瘤源性外泌體是細胞間通訊的重要介質。然而，腫瘤細胞誘導的M2型巨噬細胞與膽管癌中的PNI之間的關系尚未得到探究。在本研究中，我們運用多重免疫熒光和轉錄組測序技術，證明了LINC01812在膽管癌組織中表達上調，且其與M2型巨噬細胞浸潤呈正相關。外泌體lncRNA測序、外泌體攝取實驗、RNA下拉實驗以及質譜分析表明，巨噬細胞能夠攝取含有LINC01812的外泌體，并促進膽管癌細胞向M2型表型轉化。此外，腫瘤微環境可通過M2型巨噬細胞顯著增強膽管癌細胞的神經浸潤能力。本研究結果表明，源自膽管癌的含LINC01812的外泌體可誘導M2型巨噬細胞極化，并促進神經浸潤，從而為治療膽管癌中的PNI提供了新的潛在治療靶點。本文于2025年3月發表于“Cancer Letters”（IF=9.1）上。

技術路線：

結果：

1）CCA不同浸潤階段M1/M2巨噬細胞密度

         我們采用多重熒光染色技術，檢測了CD68、iNOS和CD206之間的關系。結果顯示，M1型巨噬細胞呈廣泛陽性信號，且在腺體組織中顯著聚集。相比之下，M2型巨噬細胞在腫瘤侵襲前沿的微環境中分布更為彌散。為驗證免疫熒光染色結果，我們對iNOS和CD206的熒光強度與細胞密度進行了定量分析。結果表明，與鄰近正常組織相比，腫瘤組織中iNOS的熒光強度和M1型巨噬細胞的密度均顯著降低，而CD206的熒光強度和M2型巨噬細胞的密度則顯著升高（圖1A）。隨后，我們對12例膽管癌（CCA）患者的樣本進行了全轉錄組測序。我們與exoRbase數據庫進行了聯合分析，并鑒定出76個差異上調的差異表達基因（DEGs）（圖1B和C）。其中，LINC01812尤為引人關注，因為它在膽管癌組織中的表達顯著升高，且在膽管癌患者來源的外泌體中富集，提示其在腫瘤-免疫細胞通訊中可能發揮作用。我們觀察到LINC01812的表達與M2型巨噬細胞浸潤呈正相關，與M1型巨噬細胞水平呈負相關，這支持了其可能參與免疫細胞分化和功能調節（圖1D）。此外，我們利用公共數據庫驗證了LINC01812與M2型巨噬細胞之間的正相關性（圖1E）。此外，我們證實了LINC01812高表達患者的基質評分和ESTIMATE評分顯著高于LINC01812低表達患者（圖1F）。基于這些結果，我們選擇LINC01812進行進一步研究，以闡明其在膽管癌中的功能作用和分子機制。

2）THP-1細胞外泌體的分離、表征和攝取

         TEM圖像顯示，外泌體呈現出典型的杯狀形態（圖2A）。NTA顯示，分離得到的外泌體的平均直徑約為110 nm，與典型外泌體的特征一致（圖2B）。Western blot實驗證實了外泌體標志物（包括Alix、HSP70、TSG101、CD81）以及陰性標志物calnexin的表達（圖2C）。共聚焦顯微鏡顯示，隨時間推移，積累在THP-1細胞周圍的外泌體數量顯著增加（圖2D）。用于分析外泌體中LINC01812表達的exoRbase數據庫顯示，其在膽汁、食管鱗狀細胞癌和黑色素瘤中的表達水平升高（圖2E）。此外，腫瘤患者血液、尿液和膽汁樣本中的LINC01812表達顯著高于健康對照組（圖2F）。

3）LINC01812促進CCA細胞的增殖、遷移和侵襲

         為探究LINC01812在CCA中的功能作用，我們首先評估了其在HIBEPIC、HUCCT1、QBC939、RBE和HCCC9810細胞中的表達水平（圖3A）。根據qPCR分析結果，選擇RBE細胞系進行LINC01812敲低實驗，并利用慢病毒載體在HUCCT1細胞中建立了LINC01812的穩定過表達細胞系（圖3B和C）。CCK-8和EdU實驗結果顯示，LINC01812敲低顯著抑制了RBE細胞的增殖（圖3D和E）。劃痕愈合實驗和Transwell實驗進一步表明，LINC01812敲低顯著降低了CCA細胞的遷移和侵襲能力（圖3F和G）。流式細胞術結果顯示，LINC01812敲低后細胞凋亡顯著增加。相反，在HUCCT1細胞中過表達LINC01812則產生了與敲低相反的效果；LINC01812過表達顯著促進了細胞增殖（圖3D）、遷移和侵襲（圖3F和G）；此外，還降低了細胞凋亡率。

4）CCA細胞外泌體衍生的LINC01812誘導M2巨噬細胞極化，促進腫瘤進展

         通過FISH技術檢測了LINC01812在CCA細胞和巨噬細胞中的亞細胞定位。結果顯示，LINC01812主要定位于細胞質中（圖4A）。采用Transwell共培養模型將HUCCT1細胞與M0型巨噬細胞共培養（圖4B和D）。與LINC01812過表達的HUCCT1細胞共培養后，M0型巨噬細胞的遷移能力顯著增強。Western blot分析證實，在此共培養條件下，M0型巨噬細胞發生了M2型極化（圖4C）。僅與外泌體共培養的結果顯示，Lenti-oe-LINC01812-exo顯著誘導M0型巨噬細胞分化為M2型而非M1型巨噬細胞（圖4E和G）。此外，添加外泌體抑制劑GW4869顯著抑制了CCA細胞來源的外泌體誘導的M0型巨噬細胞極化。qPCR證實，M2型巨噬細胞中LINC01812的表達顯著上調（圖4F）。在裸鼠皮下成瘤實驗中，研究了外泌體來源的LINC01812在CCA體內的作用（圖4H）。結果顯示，與NC-exo組相比，Lenti-oe-LINC01812-exo組的腫瘤體積和重量顯著增加；而NC-exo組的腫瘤大小和重量相對于PBS組也顯著增加（圖4I、J、4K）。

5）外泌體LINC01812通過與TUBB4B相互作用促進M2巨噬細胞極化

         我們使用生物素標記的LINC01812探針或陰性對照（NC）探針與來自THP-1 M0型巨噬細胞的總蛋白提取物進行孵育，以探究LINC01812的作用機制。利用鏈霉親和素磁珠進行下拉分析后，通過SDS-PAGE分離蛋白產物（圖5A）。采用質譜（MS）技術鑒定LINC01812結合蛋白，并選取至少兩條獨特鑒定的肽段進行進一步分析。候選蛋白包括TUBB4B、CNBP、RPF1、DDX54、PGAM2和HSPD1。利用基因表達綜合數據庫的單細胞數據對腫瘤微環境（TME）中的巨噬細胞浸潤情況進行表征。首先，將所有細胞聚類為六個亞群（圖5D），并將髓系亞群進一步重新聚類為單核細胞、M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞（圖5E）。隨后，我們分析了重新聚類的巨噬細胞亞群中TUBB4B、CNBP、RPF1、DDX54、PGAM2和HSPD1的表達水平。結果顯示，與鄰近組織相比，TUBB4B和HSPD1在癌組織中顯著高表達，而PGAM2的表達無顯著差異。因此，我們對剩余五個基因進行了擬時序分析。擬時序分析用于模擬CCA中髓系細胞的分化過程（圖5G和H），結果顯示單核細胞處于分化的早期階段；經過分支點4后，它們逐漸分化為M1型和M2型巨噬細胞。隨后，我們分析了這些結合蛋白在M2型巨噬細胞分化擬時序軌跡上的表達趨勢（圖5I）。結果表明，TUBB4B是LINC01812調控M2型巨噬細胞分化過程中的關鍵基因。分析了TUBB4B高表達組和低表達組之間的配體-受體介導的細胞相互作用（圖5J）。Western blot分析驗證了TUBB4B與LINC01812之間的相互作用（圖5C），二級質譜圖如圖5B所示。

6）外泌體LINC01812通過結合TUBB4B調控Notch通路

         與鄰近的非癌組織相比，在12例CCA樣本和TCGA數據庫的腫瘤組織中，LINC01812和TUBB4B均顯著上調（圖6A）。在TCGA-CHOL隊列中，LINC01812的高表達與較差的總生存率相關；然而，TUBB4B的表達并未顯示出顯著的預后差異（圖6B）。隨后，我們進行了原位雜交和雙重免疫熒光染色，以確定LINC01812和TUBB4B在CCA組織中的共定位情況。我們還使用免疫熒光技術分析了TUBB4B和M2型巨噬細胞極化標志物CD206的定位情況。結果顯示，LINC01812和TUBB4B在腫瘤組織中共定位（圖6C）。然而，由于CD206在腫瘤組織中廣泛分布，TUBB4B與CD206的共定位并不顯著。這些發現表明LINC01812和TUBB4B的表達水平之間可能存在相關性。對來自患者的40例CCA組織樣本進行的qPCR驗證了這些結果（圖6E）。在THP-1 M0型巨噬細胞中過表達LINC01812可增加TUBB4B的表達（圖6D）。我們用放線菌素D處理了LINC01812過表達和敲低的M0型巨噬細胞，以探究LINC01812在調控TUBB4B中的作用。如圖6F所示，在放線菌素D處理下，LINC01812過表達顯著增加了TUBB4B的mRNA表達。相反，在相同實驗條件下，LINC01812的敲低導致TUBB4B表達顯著降低（圖6F）。利用siRNA轉染THP-1來源的M0型巨噬細胞，以敲低TUBB4B。轉染48小時后，進行RNA測序分析，鑒定出1626個差異表達基因（DEGs）（圖6G）。GSEA顯示，在TUBB4B過表達組中，Notch通路基因集的表達水平較高（圖6H）。Western blot分析顯示，與NC組相比，在Lenti-oe-LINC01812過表達組中，TUBB4B和Notch通路成分（包括c-Myc、Hes1、Notch1和Notch3）的表達顯著增加（圖6I）。LINC01812誘導的Notch通路激活依賴于TUBB4B的表達，且敲低TUBB4B可有效阻斷LINC01812誘導的Notch通路激活。這表明LINC01812與TUBB4B之間存在線性調控軸（圖6J）。最后，流式細胞術顯示，與NC組相比，用Lenti-oe-LINC01812-exo處理的M0型巨噬細胞顯著向M2表型分化；然而，在M0型巨噬細胞中敲低TUBB4B顯著抑制了Lenti-oe-LINC01812-exo的作用（圖6K）。

7）外泌體LINC01812通過誘導M2巨噬細胞極化促進PNI

         外泌體可被神經元細胞攝取，并影響特定神經營養因子的分泌。因此，我們評估了在不同處理條件下PC12細胞的分化水平以及四種特定神經營養因子的分泌情況。外泌體可促進低分化PC12細胞的分化，而Lenti-oe-LINC01812-exo可進一步增強這種效果。與M2型巨噬細胞共培養可放大分化效應，使分化水平顯著升高（圖7A）。qPCR結果顯示，與NC-exo處理組相比，經Lenti-oe-LINC01812-exo處理的PC12細胞中神經營養因子的分泌水平略有增加，盡管差異無統計學意義；然而，當PC12細胞與M2型巨噬細胞共培養時，這種效應顯著增強（圖7B）。我們建立了體外CCA周圍神經浸潤（PNI）模型，通過觀察CCA細胞在基質膠中的遷移情況，進一步探索外泌體的作用。外泌體可促進CCA細胞向背根神經節（DRG）的侵襲。與M2型巨噬細胞共培養可顯著增強這種侵襲能力，而預先用GW4869處理CCA細胞則可有效抑制這一過程（圖7C）。這表明外泌體LINC01812和M2型巨噬細胞可以通過獨立和協同機制促進PNI。TCGA-CHOL數據顯示，PNI患者的LINC01812表達水平顯著升高（圖7D）。在確認巨噬細胞中的Notch通路可被外泌體LINC01812激活后，我們進行了ELISA以測量巨噬細胞上清液中CCL2的表達水平。經Lenti-oe-LINC01812-exo處理后，CCL2表達增加了約五倍。相比之下，經NC-exo處理的巨噬細胞中CCL2表達僅增加了1.6倍，這可能是由于其他補償機制對CCL2的調控所致（圖7E）。此外，本研究的作用機制示意圖如圖7F所示。

結論：

         本研究證明，CCA細胞來源外泌體可通過LINC01812-Notch-CCL2軸介導M2型巨噬細胞極化并促進神經浸潤。這一過程形成了有利于腫瘤侵襲的免疫微環境，并突顯了LINC01812作為膽管癌神經浸潤預測生物標志物的潛力。

實驗方法：

         qPCR，CCK8，傷口愈合試驗，Transwell，流式，FISH，Western blotting，RNA pull-down。

參考文獻：

         Wang Q, Sun Z, Guo J, Li H, Zhang J, Zhang B, Zhou B, Feng Y. Tumor-derived exosomal LINC01812 induces M2 macrophage polarization to promote perineural invasion in cholangiocarcinoma. Cancer Lett. 2025 May 1;617:217596. doi: 10.1016/j.canlet.2025.217596.