p53上調凋亡調節因子（PUMA）傳統上被認為可在多種癌癥中促進細胞凋亡并增強化療療效，但由于透明細胞腎細胞癌（ccRCC）對化療具有耐藥性，其在ccRCC中的作用尚不明確。該研究通過分析公共數據集、臨床組織樣本和細胞系實驗，發現PUMA在ccRCC中具有新型致癌作用，這與其已知的凋亡功能不同。PUMA的異常高表達與臨床分期呈正相關，且預示預后不良。值得注意的是，PUMA在ccRCC中的作用似乎獨立于凋亡過程，相反，它通過涉及關鍵代謝調節因子 —— 脂肪酸合成酶（FASN）的機制促進腫瘤進展和脂質積累。具體而言，PUMA的N44-102 氨基酸序列（不同于先前研究的BH3結構域）是其與FASN相互作用的關鍵。機制上，PUMA通過與泛素特異性蛋白酶 15（USP15）結合來穩定 FASN，減少FASN的泛素化和降解，從而形成PUMA-USP15-FASN軸。這些發現挑戰了PUMA在癌癥生物學中的既定認知。此外，敲低PUMA可顯著抑制腫瘤生長，并增強ccRCC腫瘤對代謝抑制的敏感性。這些結果表明，PUMA是一種新型代謝調節因子，可能成為ccRCC的治療靶點。聯合抑制PUMA和FASN進一步支持了靶向這一代謝軸的治療潛力。這篇文章于2025年6月發表在《cell death & disease》期刊上，IF:9.6。

研究技術路線：

主要實驗結果：

1、PUMA 在 ccRCC 中的高表達與臨床分期呈正相關

    作者從 GEPIA 和 UCSC Xena 數據中心獲取了 PUMA 的 mRNA 數據。GEPIA 的基因點圖分析顯示，與正常組織相比，PUMA 在 11 種癌癥類型中均呈高表達（見圖 1A），包括 ccRCC（即腎透明細胞癌，KIRC）。基于 534 例 ccRCC 患者和 72 對配對組織樣本（腫瘤及相應的正常腎組織）的數據，小提琴圖和折線圖也顯示 ccRCC 腫瘤中 PUMA mRNA 水平較高（圖 1B、C）。在 TCGA 數據集中，將 534 例 ccRCC 樣本中 RNA 水平高于中位數（7.5085）的定義為高表達，低于中位數的定義為低表達（圖 1D）。部分 Kaplan-Meier 曲線分析表明，PUMA 高表達可能與總生存期縮短相關（圖 1D 和 S1A）。通過比較 ccRCC 腫瘤組織與正常腎組織的曲線下面積（AUC）值，發現 PUMA 的表達水平具有高特異性和臨床診斷價值（圖 1E）。小提琴圖證實，PUMA 高表達與 ccRCC 的晚期腫瘤分期和癌癥分級相關（圖 1F-H）。單因素 Cox 分析顯示，PUMA mRNA 水平與多種臨床病理參數顯著相關，包括 TNM 分期。然而，多因素 Cox 分析表明，PUMA 并非獨立的預后標志物（p=0.194）。

圖 1：PUMA 在 ccRCC 中的高表達與臨床分期呈正相關。

    為進一步驗證作者的發現，作者檢查了 25 對 ccRCC 患者的臨床組織樣本。實時定量 PCR（qPCR）分析結果顯示，腫瘤組織中 PUMA mRNA 表達較正常組織顯著增加（圖 1I）。免疫組織化學分析再次證實了腫瘤組織中 PUMA 的高表達（圖 1J）。此外，Western blot 分析顯示，在 22 對組織樣本中，腫瘤組織的 PUMA 蛋白表達高于正常組織（圖 1K，L）。另外，與人類腎細胞（HK-2）相比，人類 ccRCC 細胞（A-498、ACHN、Caki-1）的 PUMA 蛋白和 mRNA 表達均較高（圖 1M，N）。值得注意的是，786-O 細胞的 PUMA mRNA 表達顯著高于 HK-2，而 786-O 與 OS-RC-2 之間的蛋白水平無顯著差異（p>0.05）。A-498 作為典型的 ccRCC 細胞系，Caki-1 代表轉移性 ccRCC。這兩種細胞系在 VHL 和 p53 上表現出不同的突變模式。作者選擇它們在后續實驗中進行比較，以強調結果的普遍性。總之，基于公共數據、臨床組織和細胞系的所有評估均證實，PUMA 在 ccRCC 中高表達，且與患者的臨床分期較高相關。

2、PUMA 在 ccRCC 中的新型致癌作用與凋亡無關

    為了研究 ccRCC 中高表達 PUMA 的生物學作用，作者將攜帶 PUMA 特異性短發夾 RNA（shPUMA）的慢病毒質粒轉染到 A-498 和 Caki-1 細胞中，以建立穩定的 PUMA 敲低細胞系。通過 Western blotting 和 qPCR 驗證，敲低效率超過 70%。對照組（CN）使用空白慢病毒質粒生成。測量關鍵凋亡通路分子以評估 PUMA 表達與凋亡的相關性，包括全長 PARP、Bcl-2、caspases-3、-6 和 - 7，以及線粒體凋亡標志物如細胞色素 C。Western blot 結果顯示，在對照組和 shPUMA 組之間，無論是全細胞裂解物還是細胞質 / 線粒體組分，凋亡標志物的表達或激活均無顯著差異。此外，細胞色素 C 保留在線粒體中，進一步支持沒有線粒體凋亡激活。對多種凋亡標志物蛋白的比較證實，在作者的模型中，PUMA 水平與凋亡活性沒有直接相關性。

    為了研究 PUMA 是否影響 ccRCC 的進展，作者對 PUMA 敲低組和對照組進行了集落形成實驗和細胞活力測試。結果表明，與對照組相比，PUMA 敲低組在 A-498 和 Caki-1 細胞系中的細胞增殖率和集落形成能力顯著降低（圖 2A-C）。Transwell 實驗顯示，與對照組相比，PUMA 敲低組的細胞遷移和侵襲能力減弱（圖 2D，E）。總之，PUMA 的敲低與 A-498 和 Caki-1 細胞系惡性進展的顯著降低相關。

圖 2：PUMA 在 ccRCC 中的新型致癌作用與細胞凋亡無關。

    ccRCC 的惡性進展由代謝重編程驅動，其特征是細胞質中糖原和脂滴的大量積累。如圖 S1F 所示，PUMA 與 ccRCC 中的葡萄糖積累沒有直接關聯，但作者觀察到其與脂滴呈正相關。與對照組相比，PUMA 敲低組在 A-498 和 Caki-1 細胞系中的脂滴含量均降低。結果通過油紅 O（ORO）染色和定量分析呈現（圖 2F，G）。與對照組相比，PUMA 敲低組中 A-498 和 Caki-1 細胞的甘油三酯和總膽固醇均降低（圖 2H），這在 ccRCC 的背景下呈現出獨特的模式。相反，在 PUMA 過表達組中，細胞增殖、脂滴、甘油三酯和總膽固醇均增加。這些發現暗示 PUMA 在促進 ccRCC 進展和脂質積累中起作用。

    為了證實作者之前的體外發現，作者在裸鼠中創建了皮下和轉移性腫瘤模型。在 PUMA 敲低組和對照組中均進行了皮下和尾靜脈注射。大體腫瘤圖像和生長曲線顯示，與對照組相比，PUMA 敲低組的腫瘤大小、重量和生長速率均降低（圖 2I-K）。免疫組織化學顯示，敲低組的 PUMA 表達顯著降低，各組之間的凋亡標志物無差異。H&E 和 ORO 染色一致顯示，PUMA 敲低組的組織切片惡性程度較低，脂質積累低于對照組（圖 2L）。在肝臟大體圖中，與對照組相比，PUMA 敲低組的肝轉移灶更少（圖 2M）。總的來說，作者進一步鞏固了之前的發現（圖 2A-H），即 PUMA 促進 ccRCC 中的腫瘤進展和脂質積累，且獨立于其在凋亡中的作用。

    近期研究強調線粒體凋亡通路的激活是腫瘤生長和轉移的驅動因素。這提出了 PUMA 可能通過亞致死信號促進 ccRCC 侵襲性腫瘤行為的可能性。按照之前的方法，作者評估了線粒體和核組分中的 EndoG 水平。與對照組相比，shPUMA 組中未觀察到 EndoG 的顯著核轉位或激活。同樣，通過 ICAD（CAD 的抑制劑）和 γH2AX（DNA 損傷標志物）分析 CAD 活性，顯示 shPUMA 組和對照組之間無顯著差異。這些結果表明，通過 EndoG 或 CAD 的亞致死信號不參與觀察到的腫瘤表型。然后，作者使用 CRISPR-Cas9 生成 ENDOG/CAD 和 BAK/BAX 雙敲除（DKO）細胞，通過 Western blotting 驗證敲除效率。對這些 DKO 細胞中腫瘤細胞生長的評估顯示，shPUMA 組和對照組之間無表型差異。因此，與 PUMA 相關的侵襲性生長表型獨立于通過 EndoG/CAD 的亞致死信號或其通過 BAX/BAK 的促凋亡功能，表明 PUMA 通過其他機制發揮作用。

3、直接相互作用：FASN 是 PUMA 功能的關鍵

    為了探索 PUMA 在 ccRCC 中的亞細胞定位，作者使用細胞質 - 核分級分離和線粒體分離實驗分析了其在不同細胞區室中的表達。Western blotting 顯示，PUMA 主要定位于 HK-2、A-498、Caki-1 和 786-O 細胞系的線粒體中。免疫熒光成像證實了細胞質 PUMA 的定位及其與線粒體標志物的共定位，與之前的研究一致。這些發現表明，鑒于線粒體在腫瘤代謝重編程（尤其是脂質代謝）中的關鍵作用，PUMA 可能參與 ccRCC 的脂質代謝。

    為了進一步探索 PUMA 在 ccRCC 內的分子相互作用，作者使用 PUMA 抗體進行免疫沉淀（IP）實驗，從全細胞和細胞質裂解物中分離蛋白質。全細胞蛋白分析顯示，與 IgG 抗體相比，PUMA 抗體下拉了 320 種蛋白質，表明 PUMA 與不同的蛋白質池相互作用。基于 IP 和 MS 結果，作者進行了基因本體論（GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。結果表明，PUMA 相關分子在代謝通路和脂質代謝通路中富集。為了提高檢測靈敏度，進行了細胞質分級分離以從細胞質中分離蛋白質。用 PUMA 抗體進行免疫沉淀從細胞質組分中獲得了 222 種蛋白質，而用 IgG 下拉了 139 種蛋白質。通過將全細胞 IP、細胞質 IP 及其各自的 IgG 對照的數據集相交，確定了 43 個潛在靶點。將細胞質 IP 數據集與脂質代謝數據進一步相交，作者發現了 28 個與脂質代謝相關的分子。值得注意的是，這 28 個分子是全細胞和細胞質數據集中 43 個靶點的一部分，驗證了它們在脂質代謝通路中的相關性。在作者的分析中，FASN 在與脂質代謝通路相關的分子中綜合得分最高。鑒于線粒體為脂肪酸合成提供乙酰輔酶 A 和檸檬酸，而 FASN 利用乙酰輔酶 A 作為其脂肪酸生物合成的底物，因此提出 FASN 是參與脂質代謝的 PUMA 的關鍵下游靶點是合理的。

    作者進一步研究了 ccRCC 中與脂質代謝相關的 PUMA 分子相互作用。基于 IP 和 MS 結果，作者重疊了三個數據集：細胞質 IgG、細胞質 IP 和脂肪酸生物合成。該分析確定 FASN（脂肪酸生物合成中的關鍵酶）是僅有的與 PUMA 相互作用的分子（圖 3A）。這一發現與圖 S4G 一致，表明 FASN 是 PUMA 在脂質代謝中作用的關鍵。內源性和外源性 Co-IP 實驗證實了 A-498、Caki-1 和 HEK293T 中 PUMA-FASN 的相互作用（圖 3B，C）。此外，BAX/BAK DKO 細胞中的 Co-IP 實驗進一步驗證了這種相互作用，表明 PUMA 與 FASN 的結合獨立于其促凋亡功能。共聚焦成像證實 FASN 主要定位于細胞質（圖 3D），并與 PUMA 共定位，尤其是在線粒體區域。這些結果突顯了 FASN 在 PUMA 介導的 ccRCC 脂質代謝中的重要作用。

圖 3：直接相互作用：FASN 是 PUMA 功能的關鍵。

    接下來，作者使用 FRET 分析和 Co-IP 測定驗證了 PUMA-FASN 相互作用。作者構建了 Clover2-PUMA 和 mRuby2-FASN 質粒，通過分別用一對 FRET 熒光團 Clover（供體）和 mRuby2（受體）標記 PUMA 和 FASN。FRET 測定結果證實了 PUMA 和 FASN 之間的直接相互作用（圖 3E，F）。作者生成了一系列 PUMA 缺失構建體（HA-PUMA ΔBH3、HA-PUMA ΔMLS、HA-PUMA ΔBH3/MLS、HA-PUMA-N43、HA-PUMA-N44–102、HA-PUMA-N103–140），并將它們與 FLAG-FASN 質粒共轉染到 HEK293T 細胞中（圖 3G）。Co-IP 結果顯示，PUMA 的 N44-102 和 N103-140 區域對其與 FASN 的相互作用至關重要（圖 3H，I）。這不同于先前公認的 BH3 結構域，后者被認為是主要的相互作用基序。最近的一篇論文提出了另一種觀點，認為 PUMA 的結合結構域可能超出傳統的 BH3 基序，其亞細胞定位可能受其表達水平和結合結構域的影響。這與作者的發現一致，即 PUMA 在其 BH3 結構域之外與 FASN 相互作用，表明參與 PUMA 在脂質代謝中作用的替代結合位點。總之，作者發現 ccRCC 中 PUMA 和 FASN 之間存在蛋白質 - 蛋白質相互作用，PUMA 的 N 端 44-140 序列在這種相互作用中起關鍵作用。

4、PUMA 介導 FASN 表達以驅動 ccRCC 進展并促進脂質積累

    FASN 在脂肪酸生物合成中至關重要，并與包括 ccRCC 在內的各種癌癥的腫瘤發生和進展相關。作者進行了 Transwell 實驗以探索 PUMA 和 FASN 之間的調節關系，發現 FASN 的補充幾乎恢復了 PUMA 敲低組的遷移和侵襲能力（圖 4A，B）。在細胞活力測定中觀察到類似結果（圖 4C）。這些發現表明，PUMA 調節 FASN 的致癌活性，從而促進 ccRCC 中的腫瘤增殖和遷移。同樣，ORO 染色和甘油三酯及膽固醇的測量顯示，FASN 的補充幾乎恢復了 PUMA 敲低組的脂滴形成和脂質代謝物水平（圖 4D-F）。這些結果與 Transwell 實驗結果一致（圖 4A，B），進一步支持 PUMA 通過 FASN 促進 ccRCC 中脂質代謝和惡性進展的作用。

圖 4：PUMA 介導 FASN 表達以驅動 ccRCC 進展并促進脂質積累。

    為了進一步研究 PUMA-FASN 相互作用的功能相關性，作者在 PUMA 敲低細胞中過表達全長 PUMA 和截短構建體（N44-102 和 N103-140）。Transwell 實驗顯示，PUMA 的補充恢復了細胞遷移，N44-102 構建體產生了類似的效果。細胞增殖和 ORO 染色測定再次證實，全長 PUMA 恢復了增殖能力和脂滴水平，添加 N44-102 基序達到了類似的結果。這些結果進一步強調了 PUMA 的 N44-102 基序在與 FASN 直接相互作用中的關鍵作用，從而促進癌細胞增殖和脂質積累。

5、PUMA 通過泛素 - 蛋白酶體途徑增強 FASN 穩定性和表達

    作者進一步探索揭示 PUMA 和 FASN 之間相互作用的機制。基于不同臨床分期（I-II 和 III-IV）的 10 對臨床組織樣本進行免疫組織化學染色。研究結果顯示，隨著惡性程度的升高，PUMA 和 FASN 的染色均增強（圖 5A）。重要的是，觀察到 PUMA 和 FASN 染色強度之間存在正相關（見圖 5A）。隨后，在 12 對 ccRCC 臨床組織樣本中檢查了蛋白質表達。觀察到 FASN 和 PUMA 的蛋白質表達之間存在正相關，與正常組相比，PUMA 敲低組中 FASN 表達顯著降低（圖 5B，C）。在體內，FASN 表達隨著 PUMA 敲低而相應降低（圖 5D）。將研究擴展到 ccRCC 細胞系，Western blotting 顯示 FASN 和 PUMA 的蛋白質水平協同升高（圖 5E）。FASN 的蛋白質和 mRNA 表達水平在 ccRCC 細胞系中高度升高，類似于 PUMA。隨后的 Western blot 分析表明，與對照組相比，PUMA 敲低組中 FASN 蛋白表達降低，而過表達 PUMA 細胞系中 FASN 蛋白表達增加（圖 5F，G 和 S6C，D）。在 qPCR 分析中，無論 PUMA 表達如何，FASN mRNA 水平均未觀察到顯著變化（圖 5G 和 S6D）。這些發現與之前的研究一致，表明 FASN 表達主要在翻譯后水平而不是 mRNA 水平受到調節。最后，與對照組相比，蛋白質穩定性測定顯示 PUMA 敲低組中 FASN 的半衰期較短（圖 5H，I）。

圖 5：PUMA 通過泛素-蛋白酶體途徑增強 FASN 穩定性和表達。

    最近的研究報道了細胞凋亡誘導與脂質代謝之間的相關性，表明 FASN 過表達也可能與細胞凋亡信號傳導相關。為了研究 PUMA 是否獨立于其促凋亡活性調節 FASN，作者評估了 BAX/BAK DKO 細胞中對照組和 PUMA 過表達組的 FASN 蛋白水平。Western blot 分析顯示，PUMA 過表達仍然導致 BAX/BAK DKO 細胞中 FASN 表達增加，與 BAX 和 BAK 完整的細胞中的觀察結果一致。這些發現證實，PUMA 調節 FASN 獨立于其促凋亡功能。

    為了研究參與 FASN 蛋白降解的途徑，作者用兩種經典的蛋白質降解途徑抑制劑處理 ccRCC 細胞系：MG132（泛素 - 蛋白酶體抑制劑，10μM）和氯喹（自噬 - 溶酶體抑制劑，25μM）。時間梯度 Western blotting 顯示，MG132 處理增加了 FASN 蛋白水平（圖 5J 和 S6F，G）。PUMA 敲低組和對照組用cycloheximide（CHX，蛋白質合成抑制劑，25μM）處理。12 小時后，每組中的一半細胞用 MG132 處理，其余一半不接受額外處理。如圖 S6H 所示，添加 MG132 導致兩組中 FASN 蛋白表達水平增加。為了進一步研究 PUMA 如何調節 FASN，作者進行了泛素化 IP 測定，結果顯示與對照組相比，PUMA 敲低組中 FASN 泛素化增加（圖 5K，L）。作者建立了穩定敲低 PUMA 的 HEK293T 細胞系，通過 Western blotting 證實。在 HEK293T 細胞中，PUMA 過表達降低了 FASN 泛素化水平（圖 5L）。這些結果表明，PUMA 通過泛素 - 蛋白酶體途徑調節 FASN 的泛素化并調控其蛋白質穩定性。

6、PUMA-USP15-FASN 軸及其與 FASN 抑制劑的協同效應

    由于 PUMA 缺乏催化活性結構域，可能需要一種中間蛋白來促進其對 FASN 泛素化的調節。回顧之前的 MS 分析結果，作者發現去泛素酶 USP7 和 USP15 可能與 PUMA 相互作用（圖 6A）。然而，關于 EIF3H 作為去泛素化酶的理解和應用仍不完整，需要進一步全面探索。在 HEK293T 細胞中，作者進行了以下組合的共轉染：（1）FLAG-PUMA 和 HA-USP7 質粒，以及 FLAG-PUMA 和 HA-USP15 質粒；（2）FLAG-FASN 和 HA-USP7 質粒，以及 FLAG-FASN 和 HA-USP15 質粒。Co-IP 結果表明，USP15 是 PUMA 和 FASN 之間的調節銜接蛋白（圖 6B）。

圖 6：PUMA-USP15-FASN 軸及其與 FASN 抑制劑的協同作用。

   通過免疫沉淀進一步驗證了 PUMA-USP15-FASN 軸。在 PUMA 敲低細胞中，與對照組相比，與 USP15 共免疫沉淀的 FASN 量減少，而 PUMA 過表達增加了與 USP15 相關的 FASN 水平（圖 6C）。在 Caki-1 和 A-498 細胞系中觀察到類似結果，表明 PUMA 敲低組中 USP15 免疫純化的 FASN 水平降低（圖 6D）。此外，HEK293T 細胞中 USP15 過表達降低了 FASN 的泛素化水平，增強了其免疫純化（圖 6E，F）。USP15 抑制后，FASN 的蛋白質表達顯著降低，與 PUMA 表達水平無關（圖 6G）。綜合這些結果，作者證實 PUMA 通過 USP15 調節 FASN 的泛素化，這鞏固了 PUMA-USP15-FASN 軸存在的合理性。

   先前的研究已將 PUMA 確立為抑制 ccRCC 惡性進展的有前景的治療靶點。然而，靶向藥物的不良反應和脫靶效應是當前 ccRCC 治療中的難題。鑒于 FASN 抑制劑單獨的臨床療效有限，越來越多的建議主張將其與其他靶點聯合使用。因此，作者深入研究了 PUMA 和 FASN 抑制劑的聯合療效。作者評估了四個不同實驗組中腫瘤細胞系的生長情況：對照組、PUMA 敲低組、用 C75（一種 FASN 抑制劑，35μM）處理的對照組，以及用 C75 處理的 PUMA 敲低組。PUMA 敲低組和用 C75 處理的對照組中腫瘤細胞增殖受到抑制，而同時接受 C75 和 PUMA 敲低的組中效果更顯著（圖 6H）。具體而言，PUMA-KD 組（與對照組相比）的抑制效率顯著高于 PUMA 和 FASN 聯合抑制組（與單獨 FASN 抑制組相比）。使用 CLZ-8（一種 PUMA 抑制劑）和 C75 評估它們在 A-498 和 Caki-1 細胞中的聯合效應。使用 Combenefit 軟件分析兩種抑制劑之間的相互作用。Combenefit 的分析顯示 CLZ-8 和 C75 之間存在明顯的協同效應（圖 6I）。此外，劑量 - 反應分析表明，增加 CLZ-8 濃度允許減少 C75 劑量，同時保持療效。這些發現強調了 PUMA 和 FASN 抑制的協同潛力，表明它們的聯合治療是臨床中 ccRCC 的有前途的治療方法。

   因此，作者進行了額外的實驗來驗證敲低 PUMA 對裸鼠中抑制劑 C75 的增強作用。分組與體外實驗一致（圖 6H）。用 C75 處理的兩組（包括圖 6H 中的對照組和 PUMA 敲低組）每周腹腔注射 20mg/kg，而沒有 C75 的對照組和 PUMA 敲低組腹腔注射等體積的生理鹽水，共 36 天。結果與體外實驗一致（圖 6H）。與任何單一干預相比，PUMA 敲低組和 C75 聯合使用顯著減緩了腫瘤生長（圖 6K）。這些發現表明，PUMA 在更廣泛的調節網絡中起作用，FASN 是關鍵但非僅有的組成部分。此外，PUMA 和 FASN 抑制的協同潛力支持它們的聯合治療作為臨床中 ccRCC 的有前途的治療策略。

7、ccRCC 中 PUMA-USP15-FASN 軸的機制模型

    總之，作者提出了 PUMA-USP15-FASN 軸的機制模型（圖 7A）。該模型揭示，ccRCC 中 PUMA 的異常高表達調節 FASN，驅動細胞內脂質積累和腫瘤的惡性進展。作者的分子研究揭示了一種新的調節機制，其中 PUMA 通過 USP15 作為銜接蛋白與 FASN 結合，形成 PUMA-USP15-FASN 軸。該軸的建立有助于揭示 ccRCC 中的腫瘤進展和脂質代謝重編程。此外，與單獨干預相比，PUMA-FASN 抑制的聯合調節可以更有效地轉化為實際臨床應用。

參考文獻

   Luo, Q., Wang, Q., Shi, J. et al. PUMA reduces FASN ubiquitination to promote lipid accumulation and tumor progression in human clear cell renal cell carcinoma. Cell Death Dis 16, 460 (2025). 

實驗方法：

細胞實驗：細胞培養及轉染、Transwell 實驗、細胞活力測定、集落形成實驗

常規分子實驗：WB、RT-qPCR、免疫組織化學與免疫熒光、油紅 O（ORO）染色、PAS反應、甘油三酯和總膽固醇測定、免疫沉淀（IP）與質譜（MS）分析、共免疫沉淀（Co-IP）實驗、熒光共振能量轉移（FRET）分析

動物模型及病理分析：體內異種移植模型