FISH原位雜交
microRNA原位雜交 RNA原位核酸雜交(RNA nucleic acid hybridization in situ)又稱RNA原位雜交(RNA in situ hybridization RISH)。該技術(shù)是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細胞和組織內(nèi)RNA表達的一種原位雜交技術(shù)。其基本原理是：在細胞或組織結(jié)構(gòu)保持不變的條件下，用標記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則，與待測細胞或組織中相應的基因片段相結(jié)合(雜交)，所形成的雜交體(Hybrids)經(jīng)顯色反應后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細胞內(nèi)相應的RNA分子。現(xiàn)在探針標記技術(shù)有生物素、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶和熒光素。 microRNA原位雜交實驗流程: 
 具體實驗操作步驟 1、脫蠟： 1）二甲苯脫蠟3次，每次5min； 2）100％酒精兩次，每次2min； 3）移出酒精，斜置切片，標記末段向下，空氣干燥。 2、蛋白酶處理: 1）每個染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中預熱。將消化酶液加入管內(nèi)，搖動直到酶溶解。 2） 37℃水浴槽中預熱染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。 3） ×SSC在室溫下漂洗切片3次，每次1min。 4）梯度酒精脫水（-20℃預冷）。 3、變性： 1）每一個立式染色缸配制40ml變性溶液； 2）78℃水浴槽中平衡預熱混合液染色缸； 3）78℃孵育8min； 4） 即移入-20℃預冷70%酒精的染色缸內(nèi)2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃預冷酒精內(nèi)，每缸2min； 5）空氣干燥。 4、雜交： 1）準備探針； 2）取一個較大的濕盒，交叉放置切片； 3）滴10μl探針在切片的組織上，加蓋玻片； 4）蓋上濕盒蓋，37℃孵育12h～16h。 雜交后的水洗： 5）鑷子小心去除蓋玻片； 6）43℃預熱雜交后水洗溶液40ml水洗切片15min； 7）2×SSC(37℃)洗兩次，每次10min； 8）切片放人染色缸的1×PBS內(nèi)待檢測，勿使切片干燥。 檢測： 9）從1×PBS中取出切片，除去過多的水分，避免標本干燥。把切片放入濕盒內(nèi)，同時處理4張切片。 10）每張切片使用30μl～60μl羅丹明抗-抗體或FITC卵白素，室溫下孵育20min； 11）去掉塑料蓋膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min。 擴增： 12）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出； 13）每張切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min； 14）去掉塑料蓋膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min； 15）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出； 16）每張切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min； 17）1×PBS室溫下洗3次，每次2min。 5、細胞核染色： 1）張切片加10μl～20μl DAPI，覆蓋蓋玻片并在室溫下孵育2～5ml； 2）盡可能快的在熒光顯微鏡下觀察或封閉盒內(nèi)保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h內(nèi)可以在顯微鏡下觀察。 |
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